Руководство лабораторных работы по микробиологии

МИНИСТЕРСТВО
ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное
государственное бюджетное образовательное
учреждение

высшего
профессионального образования

«МОСКОВСКИЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»

Н.Г.Ильяшенко,
Т.В.Пичугина

Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии Электронное учебно-методическое пособие

Рекомендовано учебно-методическим
объединением по образованию в области
технологии продуктов питания и пищевой
инженерии в качестве учебно-методического
пособия для студентов высших учебных
заведений, обучающихся дистанционно
по направлениию 260100 «Технология продуктов
питания» и по направлениям подготовки
дипломированных специалистов 260200
«Производство продуктов питания из
растительного сырья», 260500 «Технология
продовольственных продуктов специального
назначения и общественного питания»

Утверждено

Научно-методическим советом
ИТиПМ

«…» ноября 20011 г.

Москва 2012

Предисловие

Электронный вариант методического
руководства предназначен для студентов
высших учебных заведений направления
260100 «Производство пиодуктов питания
из растительного сырья» изучающих
дисциплину «Микробиология» и обучающихся
дистанционно. Методическое пособие
подготовлено в соответствии с
программой учебной дисциплины (2001г.) по
указанному направлению, а также в
соответствии с Государственным
образовательным стандартом высшего
профессионального образования и
Государственными требованиями к
обязательному минимуму содержания и
уровню подготовки выпускников по
указанным направлениям.

Практические занятия по
микробиологии сопровождают теоретический
курс по этой дисциплине, который читается
студентам в течение многих лет на
кафедре «Процессы ферментации и
промышленного биокатализа» Московского
Государственного университета пищевых
производств.

Курс практических занятий рассчитан
на студентов, начинающих знакомство с
основами микробиологии, и поэтому
содержит краткое изложение некоторых
общих теоретических положений этой
науки по основным темам практических
занятий, предусмотренных программой,
и подробное описание методов и приемов
для проведения занятий. Даются вопросы
для самопроверки, а также указываются
главы электронного учебника (Пичугина
Т.В., Ильяшенко Н.Г. «Микробиология»
2008г.). Представленные в руководстве
рисунки и схемы должны служить
вспомогательным материалом и облегчить
студентам самостоятельную работу при
освоении методов дисциплины «Микробиология».

Курс состоит из 4 тематических и 2
контрольных занятий (по 3…4 час) и включает
следующие разделы:

1. Светопольная микроскопия. Устройство
   микроскопа и техника микроскопирования.

2. Морфология микроорганизмов.

3. Культивирование микроорганизмов.

4. Микроорганизмы природных биотопов.

Выполнение заданий по темам 1 и 2
рассчитано на одно лабораторное занятие,
а по темам 3 и 4 — на два занятия.

Студенты дневного отделения (34 часа)
выполняют задания по четырем темам,
которые рассчитаны на восемь занятий;
студенты вечернего и заочного отделений
также выполняют задания по указанным
темам, но при этом отдельные задания
объединяются.

На предпоследнем седьмом занятии, и
заключительном восьмом занятии, которое
проводятся студентами самостоятельно,
студенты выполняют контрольное задание
– исследование микроорганизмов воздуха
закрытых помещений. На седьмом занятии
студенты делают посев на плотные
питательные среды с целью получения
накопительных культур микроорганизмов.
На заключительном восьмом занятии они
осуществляют количественный и качественный
учет микроорганизмов воздуха по
Омелянскому. Студентами проводится
ориентировочная идентификация выросших
микроорганизмов на плотной питательной
среде с подробным описанием культуральных
и основных морфологических признаков,
а затем проводят оценку микробиологического
состояния исследуемого помещения. После
выполнения указанных заданий студент
получает зачет по практической части
дисциплины «Микробиология».

ПРАКТИКУМ
ПО МИКРОБИОЛОГИИ

(с
разделом Цитология)

На
основе

Набора
для проведения экспериментов по микробиологии.

Содержание

Практикум
по
микробиологии                                                                                     
                           3

Общие
указания к проведению лабораторных работ (Правила работы в
лаборатории)                    5                            Л/р №1 Дезинфекция
и
стерилизация                                                                   
                                  7

Л/р
№2 Исследование степени загрязненности воздуха помещений методом оседания
Коха       10

Л/р
№3 Выращивание на питательной среде микроорганизмов зубного налета                             
13

Л/р
№4 Изучение морфологии бактерий, грибов,
дрожжей                                                               14

Л/р
№5 Приготовление препаратов микроорганизмов и их окраска                                                 19

Л/р
№6 Строение плесневых грибов и
дрожжей                                                                                  26

Л/р
№7 Микроорганизмы вред или
польза                                                                                           35

Л/р №8 Влияние факторов внешней среды на
развитие микроорганизмов                                      36

Л/р №9 Изучение морфологии
дрожжей                                                                                              47

Л/р
№10 Изучение культуральных свойств выросших в чашках колоний                                        50

Л/р
№11 Выращивание микроорганизмов                                                                                            53

Л/р
№12 Выращивание своих собственных
микроорганизмов                                                          54

Л/р
№13 Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам                                  55

Раздел Цитологии. Л/р №14 Изучение
плазмодесмы в клетках эндосперма хурьмы                      56

Л/р №15 Молодые клетки зачатка листа                                                                       
                       57

Л/р №16 Живые клетки чешуи лука                                                                                                     
58

Л/р №17 Строение зрелого листа элодеи                                                        
                                     59

Л/р №18 Биологические мембраны. Плазмолиз                                                                                  
60

Л/р №19 Строение лейкопластов                                                           
                                               62

Л/р №20 Крахмальные зерна                                                                                                                 
63

Л/р №21 Методы обнаружения белков                              
                                                                  64

Л/р №22 Методы обнаружения углеводов                                                                                           66

Приготовление
красителей                                                                                                                    68

Список используемой
литературы                                                                          
                             72

Практикум
по микробиологии

Разработан
в соответствии с рабочей программой дисциплины «Биология и микробиология» для
учеников школы и студентов, составленной на основе новых государственных
стандартов. Он включает в себя лабораторные работы, которые охватывают основные
разделы микробиологии.

Практикум
составлен таким образом, чтобы закрепить теоретические знания по основным
разделам курса, получить представление о строении живых организмов, показать их
значение и развить у учащихся навыки практической работы. Поэтому перед каждой
работой дается краткая теоретическая часть, необходимая для понимания
эксперимента. Перед выполнением лабораторной работы учащиеся должны с ней
ознакомиться.

При
выполнении лабораторных работ студенты получают экспериментальные навыки,
необходимые им для самостоятельной работы. Они осваивают методы биологического
и микробиологического исследования, правила работы с биологическим материалом и
культурами микроорганизмов.

Особое
внимание уделено работе с микроскопом и правилам работы в лаборатории биологии
и микробиологии. На первом занятии учащиеся должны ознакомиться с техникой
безопасности, правилами работы в лаборатории и выполнять лабораторные работы в
соответствии с этими правилами.

Результаты
каждой лабораторной работы оформляются в виде отчета. Отчет выполняется
рукописным методом в тетради или на отдельных листах с титульным листом на
нечетной странице, у которого обратная сторона остается чистой. Далее следуют
разделы в следующей последовательности: цель работы, задание, ход выполнения
работы, таблицы, рисунки и общий вывод по результатам ее выполнения.

В
основе лабораторных работ лежит Набор для проведения экспериментов по
микробиологии.

ОБЩИЕ
УКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ

ЛАБОРАТОРНЫХ
РАБОТ

При
выполнении лабораторных работ по биологии и микробиологии работают с различным
биологическим материалом и культурами микроорганизмов. Изучают строение живых
организмов и их основную структурную единицу – клетку. Клетки имеют небольшие
размеры, поэтому невооруженным глазом их рассмотреть невозможно. Для их
изучения готовят определенным образом препараты, которые рассматривают под
микроскопом.

 Микробиология
изучает мельчайшие, невидимые невооруженным глазом существа – микробы. Они
находятся повсюду: в почве, воздухе, воде, на сырье, различных материалах,
оборудовании, продуктах питания и т. д. Одни из них безопасны для человека,
другие могут вызывать различные заболевания.

Увидеть
микроорганизмы, так же как и отдельные клетки, можно только под микроскопом,
приготовив соответствующим образом препараты.

В
лаборатории каждый работающий должен сидеть за отдельным столом.

В
лаборатории должны быть созданы условия, обеспечивающие стерильность работы,
при которых будет исключена возможность попадания как посторонних
микроорганизмов извне, так и микроорганизмов из лаборатории в окружающую
среду. Поэтому в микробиологической лаборатории необходимо строго соблюдать
определенные правила работы и поведения, которые предотвращают возникновение
заражения.

Правила
работы в лаборатории

1.
В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды – халата.

2.
Не разрешается выходить в халате за пределы лаборатории и надевать на халат
верхнюю одежду.

3.
В помещении лаборатории запрещается принимать пищу и хранить продукты питания.

4.
Не выносить за пределы лаборатории какие бы то ни было посуду и материалы,
которые используются для проведения лабораторных работ (пробирки, краски и т.
д.).

5.
Не класть на стол личные вещи (сумки, папки и др.), держать их на специально
отведенных местах.

6.
Если микроорганизмы попадают на оборудование или пол (разобьется пробирка или
чашка Петри, на которой они росли), об этом надо сразу же сообщить
преподавателю или лаборанту, а на данном месте провести обеззараживание, залив его
дезинфицирующим раствором. После этого необходимо провести уборку.

7.
Во время выполнения практических работ нельзя открывать форточки. Необходимо соблюдать
тишину, избегать лишнего движения и хождения, открывания и закрывания дверей –
всего того, что усиливает движение воздуха.

8.
Перед началом работы дежурные проводят влажную уборку помещения, а столы
протирают дезинфицирующим раствором.

9.
Каждый учащийся перед началом работы должен проверить, все ли необходимое
находится на его столе и исправен ли микроскоп.

10.
Раздача необходимого для проведения лабораторной работы материала и посуды
проводится лаборантом или дежурными.

11.
На занятиях учащиеся должны иметь тетрадь и карандаши (простой и цветные –
красный и синий). Рисунки при микроскопировании надо делать с препаратов, а не
из книг или пособий.

12.
По окончании работы все используемые инструменты обеззараживают. Бактериальные
петли и иглы прокаливают над пламенем спиртовки, а пипетки и стекла помещают в
дезинфицирующий раствор.

13.
В конце занятий надо привести в порядок рабочий стол, протереть и убрать
микроскоп, тщательно вымыть руки (при работе с заразным материалом их сначала
дезинфицируют) и снять халат.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 1

ДЕЗИНФЕКЦИЯ
И СТЕРИЛИЗАЦИЯ

Цель
работы:

Ознакомиться
с методами дезинфекции и стерилизации.

Материалы
и оборудование: чашки Петри, пробирки, пипетки,
парафильм или пищевая пленка, спиртовка

Теоретическая
часть:

В
естественных условиях микроорганизмы подвергаются воздействию разных по своей
природе факторов внешней среды, которые могут либо стимулировать (стимулирующее
действие), либо замедлять и прекращать их развитие, тормозя метаболические
процессы (бактериостатическое действие), либо вызывать гибель микроорганизмов
(бактерицидное действие).

В
зависимости от своей природы все факторы делятся на физические, химические и
биологические. Наиболее сильное воздействие на микроорганизмы оказывают
следующие физические и химические факторы: температура, влажность, осмотическое
давление, ультрафиолетовые лучи, ионизирующая радиация, ультразвук, различные
химические вещества и рН среды. Многие из этих факторов используются для
подавления жизнедеятельности микроорганизмов.

Дезинфекция
широко применяется не только в лабораториях микробиологии, но и на различных
пищевых предприятиях. В качестве дезинфицирующих веществ наибольшее
практическое применение находят хлорная известь (0,5–5%-ные водные растворы),
хлорамина (1–5%-ные водные растворы), йод (2%-ный раствор), фенол и его
производные (1–5%-ные растворы), этиловый и изопропиловый спирт (70%-ные
растворы).

Выбор
дезинфицирующего вещества, его концентрация, продолжительность срока
дезинфекции зависят от конкретных условий: от того, что именно подвергается
дезинфекции, степени предполагаемого микробиального загрязнения, устойчивости
обеззараживаемых микроорганизмов.

Стерилизация
(обеспложивание) – это полное уничтожение всех микроорганизмов (вегетативных и
споровых, патогенных и непатогенных) в обрабатываемом объекте. При проведении
микробиологических исследований для получения правильных результатов необходимо
обеспечить стерильность работы, т. е. не допустить попадания и развития
посторонних микроорганизмов. Это достигается в результате проведения работ
только при строго определенных условиях (определенных требованиях к помещению,
оборудованию, посуде, питательным средам и т. д.).

Посуда,
инструменты, питательные среды, используемые для работы в лаборатории
микробиологии, должны быть стерильными, поэтому стерилизация является одной из
важнейших операций в практике проведения микробиологических исследований.

Стерилизацию
можно проводить различными способами: прокаливанием, паром под давлением,
текучим паром, сухим жаром, кипячением, фильтрацией и др. Выбор способа
стерилизации зависит от свойств стерилизуемого объекта, так как стерилизация не
должна приводить к изменению его физического или химического состояния. Так,
например, питательные среды никогда не будут стерилизовать сухим жаром, так как
в их состав входит вода, которая при этом испарится.

Ход
работы:

1.    
Подготовить посуду к стерилизации.

Перед
стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Новую посуду вначале кипятят в
воде, в которую добавляют соляную кислоту так, чтобы получился 1%-ный раствор,
затем промывают холодной водой и, не вытирая, высушивают. Посуду, бывшую в
употреблении, выдерживают в 20%-ном растворе серной кислоты в течение суток,
затем моют в горячей воде, тщательно прополаскивают и высушивают.

Чашки
Петри, пробирки и пипетки перед стерилизацией закрывают пленкой. Чашки Петри
стерилизуют, завернув их в бумагу по 1–5 штук. В бумагу заворачивают и пипетки.

 2.
Приготовить к стерилизации 3–5 пробирок и 1–2 колбы. Для этого чистые пробирки
и колбы закрывают пленкой.

3.
Подготовить к стерилизации 3–5 пипеток.

В
верхнюю часть каждой пипетки вставляют кусочек ваты, чтобы ее содержимое при
работе не могло попасть в рот.

4.
Подготовить к стерилизации вату и марлю.

Перед
стерилизацией марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков,
после чего заворачивают их в плотную бумагу по 1–3 штуки так, чтобы она не
разворачивалась. Удобно из бумаги сделать кулечки, положить туда вату или марлю
и хорошо закрыть кулечки.

5.
Провести стерилизацию посуды.

Подготовленную
к стерилизации посуду и вату загружают в сушильный шкаф. Их кладут не слишком
плотно, для того чтобы воздух мог хорошо циркулировать по всей камере и обеспечивался
равномерный нагрев. После этого дверцу шкафа закрывают и включают нужную
температуру.

6.
Провести стерилизацию бактериальных петель.

Бактериальные
петли стерилизуют в пламени спиртовки. Петли делают из нихромовой или
платиновой проволоки, чтобы при прокаливании на них не появлялась окалина. Если
петля сухая, то ее в вертикальном положении вносят в верхнюю, самую горячую
часть пламени и прокаливают до красного каления сначала ее нижнюю, а затем
верхнюю часть.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2

Исследование
степени загрязненности воздуха помещений методом оседания Коха

Воздух – это среда, содержащая
огромное количество микроорганизмов, которые могут с воздухом переноситься на
значительные расстояния. В воздухе микроорганизмы сохраняются лишь некоторое
время, после чего гибнут из-за воздействия ряда факторов: солнечной радиации,
перепада температуры, отсутствия необходимых питательных веществ. Наиболее
устойчивые микроорганизмы могут долго сохраняться в воздухе. К такой постоянной
микрофлоре воздуха относятся споры грибов и бактерий, сарцины и др.

В воздухе закрытых помещений
могут содержаться загрязнения бактериальной и химической природы. Они являются
следствием физиологических обменных процессов человека, бытовых действий
(напр., приготовления пищи). В воздух помещений может поступать также комплекс
продуктов деструкции полимерных отделочных материалов и т. д. Наконец, газовый
состав воздух закрытых помещений определяется газовым составом приточного
атмосферного воздуха и химическими веществами-загрязнителями, выделяемыми
внутри помещений.

В воздухе закрытых помещений
обнаруживаются микроорганизмы, постоянно обитающие в больших количествах на
слизистых оболочках верхних дыхательных путей человека. Они выделяются в
окружающую среду при чиханье, кашле, смехе и разговоре с мельчайшими частицами
слюны  и носоглоточной слизи.

Основная причина загрязнения
воздуха помещений жилых и общественных зданий – накопление углекислого газа,
аммиака, сероводорода, летучих жирных кислот и др. В воздухе закрытых помещений
находится много бактерий, так как в большинстве таких помещений неизбежно
массовое хождение, сопровождающееся поднятием в воздух пыли.

Цель работы: 

Исследование степени
загрязнённости воздуха школьных помещений    методом оседания
Коха.

Материалы и оборудование:
стерильные чашки Петри (5 шт.),
алюминиевая фольга, стаканы с питательной средой, лупа, термостат. Стержень, основание
штатива, марлевые повязки, перчатки, иглы, петли

Ход работы:

Основной этап работы включает
проведение опыта. Опыт проводится 2 раза: первый раз –  в конце учебного
дня, второй раз – через 2 в начале учебного дня. После проведения основной
части каждого опыта (поверхностный посев), чашки Петри помещаются в термостат
при t = +37°C на неделю, после чего регистрируются результаты исследования.

Заключительный этап работы
включает подсчёт колоний микроорганизмов и количественный учёт микробов в 1 м³ воздуха
каждого исследуемого помещения, составление выводов по работе, обсуждение
итогов исследования, подготовку фотоотчёта и презентации.

Культивирование бактерий

Культивирование (выращивание)
микробов, в частности, бактерий проводится на питательных средах.

Методика проведения
исследования

Метод заключается в том, что
чашку Петри с МПА оставляют на некоторое время открытой (поверхностный посев),
а затем закрывают крышкой и ставят в термостат при t = 37°C. О степени
загрязнённости воздуха судят по количеству выросших колоний. Метод даёт
приблизительные результаты количества микроорганизмов в единице объёма воздуха.

Чашки Петри с агаром ставим в
разные помещения. Открываем на 5 минут, а затем закрываем. На крышке отмечаем
место, где был проведён анализ. Чашки помещаем в термостат при + 37°С. (или в
холодильник) Выдерживаем не более недели.

Подсчитывает под лупой число
колоний, выросших на МПА. Определяем площадь дна чашки Петри. Зная число
колоний, рассчитываем количество бактерий в 1 м³ воздуха. 
На поверхности питательной среды в 100 см³ в течение 5 минут
при спокойном состоянии оседает количество микроорганизмов, содержащихся в 100
л воздуха. Например, в чашке Петри диаметром 10 см выросло 25 колоний. Площадь
питательной среды в чашке Петри равна 78,5 см². Вычисляем количество
колоний на 100 см²:

25 колоний – 78,5 см²
Х колоний – 100 см²
Х = 32 колонии

Вычисляем количество бактерий
в 1м³ воздуха (1000 л):

32 – 10 л
Х – 1000 л
Х = 3200 спор

Следовательно, в 1м³ воздуха
содержится 3200 спор клеток микроорганизмов.

Критерии для оценки
загрязнённости помещений по числу микроорганизмов в 1 м³ воздуха.

Результаты работы (как
образец)

В ходе исследования для
микробиологической оценки воздуха каждого помещения использовалось по 1 чашке
Петри. На основании подсчёта колоний, выросших в чашках Петри, была проведена
оценка содержания микроорганизмов в 1 м³ воздуха помещения.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 3

Выращивание
на питательной среде микроорганизмов зубного налета  

Цель работы:

Вырастить и изучить микроорганизмы находящиеся в зубном налете.

Материалы и оборудование: чашка Петри, питательная среда Чапека, агар, шпатели, иглы,
парафильм или пищевая пленка, зубочистки, марлевая повязка, перчатки.

Практическая часть:

1.    
Приготовить питательную среду
и разлить ее по чашкам Петри, накрыть пленкой до опыта.

2.    
В чашке Петри на питательной
среде оставить мазок с зубов

3.    
Наблюдать за ростом
микроорганизмов

4.    
Охарактеризовать колонии
микроорганизмов, использую теоретическую часть практикума.

5.    
Сделать выводы.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА №4

Изучение
морфологии бактерий, грибов и дрожжей

Цель работы:

Ознакомиться с морфологическим разнообразием бактерий и
основными признаками, используемыми при их идентификации.

Материалы и оборудование: Микроскоп; пипетка; предметные стекла; спиртовка;
иммерсионное масло; фильтровальная бумага; набор красок для окраски по Граму
(фильтровальные бумажки с генцианвиолетом, растворы Люголя и фуксина рабочего)
и окраски спор по Шефферу-Фултону (растворы бриллиантовой зелени и сафранина);
96 %-ный этиловый спирт; поднос для предметных стекол; промывалка; питательные
среды с заранее выращенными бактериями и грибами; марлевая повязка, перчатки

Теоретическая часть:

Морфологические
признаки бактерий

Бактерии объединяют обширную группу в основном
одноклеточных микроорганизмов, разнообразную по форме, размерам и обмену
веществ. Они являются  прокариотными микроорганизмами.

При дифференциации бактерий путем микроскопии учитывают
размеры и формы клеток, их взаимное расположение, химический состав и строение
клеточных стенок, способность образовывать споры и капсулы, подвижность.

Основными формами бактерий, которые присутствуют в пищевом
сырье, а также в продуктах растительного и животного происхождения, являются
сферические бактерии (кокки) и палочковидные бактерии (палочки).

К основным морфологическим
признакам кокков относятся их
размеры (диаметр кокков в среднем составляет 1…2 мкм) и взаимное расположение. Взаимное
расположение кокков определяется направлением образования перегородок при
делении клеток.  Если после деления клетки расходятся и располагаются
поодиночке, то такие формы называются монококками или микрококками.
Если при делении образуются скопления, напоминающие виноградные грозди, их
относят к стафилококкам. Кокки, остающиеся после деления в одной
плоскости связанными парами, называются диплококками, а образующие
разной длины цепочки – стрептококками. Сочетания из четырех кокков,
появляющиеся после деления клетки в двух взаимно перпендикулярных плоскостях
представляют собой тетракокки. Если кокки делятся  в трех взаимно
перпендикулярных плоскостях, то они образуют скопления кубической формы —
сарцины. Как выглядят различные скопления кокков под микроскопом изображено
на рис. 3.

Рис. 3 Взаимные расположения кокков: а —  микрококки; б
— диплококки;

в — стрептококки; г — тетракокки; д — стафилококки; е —
сарцины

Основными морфологическими
признаками палочковидных бактерий,
которые определяются путем микроскопии,  являются размеры палочек (средняя
длина палочек – 2…7 мкм, диаметр в поперечнике —  0,5…1 мкм), взаимное
расположение клеток, способность образовывать споры, подвижность.

Палочковидные бактерии могут располагаться поодиночке,
попарно (диплобактерии) и цепочками (стрептобактерии).

При микроскопии легко можно определить спорообразующие и не
спорообразующие формы палочковидных бактерий. Вегетативные клетки хорошо
адсорбируют красители на своей поверхности и полностью окрашиваются. Оболочка
споры малопроницаема, краски в них почти не проникают и под микроскопом споры
имеют вид округлых или овальных блестящих зерен. Палочки, образующие споры
называются бациллами и клостридиями. У бацилл размер споры не
превышает ширину клетки и поэтому при образовании споры форма клетки не
меняется. У клостридий диаметр споры больше толщины клетки и поэтому при
созревании споры клетка приобретает форму веретена (если спора располагается в
центре клетки) или барабанной палочки (если спора располагается на одном из
полюсов клетки). На рис. 4 представлены морфологические разновидности
палочковидных бактерий.

Рис. 4  Морфология палочковидных бактерий: а —
диплобактерии;

б — стрептобактерии; в — бациллы; г — клостридии

При идентификации палочек диагностическое значение имеют
также расположение спор в клетках бацилл и клостридий, наличие и расположение
жгутиков, способность образовывать капсулы.

Морфологические
признаки грибов

Грибы относятся к царству Fungi (Mycetes, Mycota). Это мно­гоклеточные или одноклеточные нефотосинтезирующие
(бесхлорофилльные) эукариотические микроорганизмы с клеточной стенкой. 

Грибы имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с органеллами, цитоплазматическую
мембрану и многослойную, ригидную клеточную стенку, состоящую из нескольких
типов полисахаридов, а также белка, липидов и др. Некоторые грибы образуют
капсу­лу. Цитоплазматическая мембрана содержит гликопротеины, фосфолипиды и
эргостеролы. Грибы являются грамположительными микробами, вегетативные клетки —
не­кислотоустойчивые.

Грибы состоят из длинных тонких нитей (гиф),
спле­тающихся в грибницу, или мицелий. Гифы низших грибов — фикомицетов — не
имеют перегородок. У высших грибов — эумицетов — гифы разделены перегородками;
их мицелий многокле­точный.
Различают
гифальные и дрожжевые формы грибов.

Гифальные (плесневые) грибы образуют ветвящиеся тонкие нити (гифы), сплетающиеся
в грибницу, или мицелий (плесень). Гифы, врастающие в питательный субстрат,
называются вегетатив­ными гифами (отвечают за питание гриба), а растущие над
поверхностью субстрата — воздушными или репродуктив­ными гифами (отвечают за
бесполое размножение).

Гифы низших грибов не имеют перегородок. Они пред­ставлены многоядерными клетками и
называются ценоцитными.

Гифы высших грибов разделены перегородками, или сеп­тами с отверстиями.
Дрожжевые грибы (дрожжи), в основном, имеют вид от­дельных овальных клеток
(одноклеточные грибы). По типу полового размножения они распределены среди
высших грибов — аскомицет и базидиомицет. При бесполом размно­жении дрожжи
образуют почки или делятся, что приводит к одноклеточному росту. Могут
образовывать псевдогифы и ложный мицелий (псевдомицелий) в виде цепочек удлинен­ных
клеток — «сарделек». Грибы, аналогичные дрожжам, но не имеющие полового способа
размножения, называют дрожжеподобными. Они размножаются только бесполым
способом — почкованием или делением. 

Грибы размножаются спорами половым и бесполым
спосо­бами, а также вегетативным путем (почкование или фрагмента­ция гиф).
Грибы, размножающиеся половым и бесполым путем, относятся к совершенным.
Несовершенными называют грибы, у которых отсутствует или еще не описан половой
путь размно­жения. Бесполое размножение осуществляется у грибов с помощью
эндогенных спор, созревающих внутри круглой структуры — спорангия, и экзогенных
спор — конидий, форми­рующихся на кончиках плодоносящих гиф.

Практическая часть:

1.     Взять чашки Петри с выращенными колониями грибов и бактерий, с помощью
пипетки сделать микропрепараты бактерий и грибов.

2.     Рассмотреть препараты под микроскопом.

3.     Зарисовать увиденные клетки грибов и бактерий.

4.     Сделать выводы.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 5

Приготовление
препаратов микроорганизмов и их окраска

Цель
работы:

Научиться
готовить препараты микроорганизмов и проводить их окраску.

Задачи:

1.
Ознакомиться с приготовлением препаратов бактерий в «раздавленной» и «висячей»
каплях.

2.
Приготовить три препарата и окрасить их:

     
– первый – простым способом;

     
– второй – сложным способом (по Граму);

     
– третий – способом, при котором окрашиваются споры.

3.
Промикроскопировать окрашенные препараты.

4.
Оформить отчет, зарисовать увиденное под микроскопом в тетрадь и сделать
выводы.

Материалы
и оборудование: предметные стекла, иглы, петли, спиртовка,
пинцет, генцианвиолет, йод, фильтровальная бумага, этиловый спирт, 96%р-р
спирта, р-р Люголя, эфир, карболовый фуксин Циля, 0,5% р-р соляной кислоты, 5%
р-р серной кислоты, метиленовая синь Лефлера, марлевые повязки, перчатки.

Теоретическая
часть

Микроскопирование
микроорганизмов можно проводить на живых видах и в убитых культурах, в
окрашенном и неокрашенном состоянии. Микроорганизмы содержат большое количество
воды, и свет через них хорошо проходит, поэтому для того, чтобы увидеть их под
микроскопом, необходимо правильно приготовить соответствующие препараты.

Препараты
обычно готовят на предметном стекле. Помимо них, иногда используют и покровные
стекла. Все стекла, используемые для приготовления препаратов, должны быть
безупречно чистыми. Для этого их предварительно тщательно моют.

Для
определения формы или выявления подвижности микроорганизмов их микроскопируют в
живом состоянии. Для этого готовят препарат типа «раздавленная капля» или
«висячая капля».

Раздавленная
капля. Для приготовления этого препарата на середину предметного стекла наносят
каплю воды или другой прозрачной жидкости и вносят в нее немного исследуемых
микроорганизмов. Каплю осторожно накрывают («раздавливают») покровным стеклом.
Для этого покровное стекло берут за грани, ставят на ребро у края капли и
осторожно опускают, постепенно вытесняя воздух между покровным и предметным
стеклом, чтобы не допустить образования в жидкости пузырьков воздуха.

Жидкость
должна тончайшим слоем заполнить все пространство между стеклами, но не
выступать за края покровного стекла. Излишек выступившей жидкости удаляют
фильтровальной бумагой. Если жидкости недостаточно и между стеклами осталась
воздушная полость, воду, наоборот, добавляют, подпуская ее стеклянной палочкой
под покровное стекло, или заново переделывают препарат.

При
исследовании бактерий и дрожжей, выращенных на плотной среде, берут небольшое
их количество бактериологической иглой, предварительно прокаленной в пламени
спиртовки и охлажденной. Затем вносят их в каплю воды, которую нанесли на
предметное стекло, и тщательно перемешивают. При исследовании  грибов берут
небольшой комочек мицелия с помощью двух препаровальных игл (вставленных в
пластмассовые или деревянные палочки). Мицелий помещают на предметное стекло в
каплю смеси спирта и глицерина и осторожно расщепляют иглами, стараясь как
можно лучше разъединить гифы.

Если
исследуемые микроорганизмы (бактерии, дрожжи, споры грибов) находятся в жидкой
среде, то на предметное стекло наносят каплю микробной суспензии (взвеси) без
добавления воды или другой жидкости. Суспензию берут стеклянной палочкой или
бактериологической петлей.

Бактерии
и дрожжи микроскопируют с объективом 40х, грибы – с объективами 8х или 10х и
20х или 40х. Можно микроскопировать их и с объективом 90х или 100х, используя
при этом особо тонкое покровное стекло, на поверхность которого наносят
иммерсионное масло.

Микроорганизмы,
находящиеся в препарате «раздавленная капля», можно изучать и в темном поле
зрения. В этом случае толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, а
покровных – 0,2 мм. Микроскопирование в темном поле проводят на обычном
световом микроскопе, заменив в нем конденсор на темнопольный. В таком
конденсоре центральная часть затемнена и свет проходит только через
периферийную часть линзы. Он проходит его под углом, и поэтому в глаза
исследователя прямые лучи света не попадают. Виден только свет, отраженный от
микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы видны на темном фоне как ярко
освещенные частицы.

Для
изучения подвижности микробов, процесса прорастания спор и т. д. готовят препарат
типа «висячая капля». Для этого на середину необезжиренного покровного стекла
наносят каплю жидкости с микроорганизмами. Края стекла смазывают вазелином,
осторожно переворачивают и кладут на предметное стекло, которое посередине имеет
углубление, так, чтобы капля находилась в углублении. Она должна свободно
свисать, не касаясь краев или дна углубления.

В
подавляющем большинстве под микроскопом рассматривают окрашенные препараты
микроорганизмов. Окраска микроорганизмов зависит от физико-химических
особенностей микробной клетки и взаимодействия ее структур и  веществ с
используемыми реактивами.

Способы
окрашивания делятся на простые и сложные. При простых способах окраски используют
один краситель, например фуксин. Такая окраска применяется для ознакомления с
морфологией бактерий.

При
сложных способах окраски применяют два или более красителя и используют различные
обесцвечивающие вещества(чаще всего спирт). Такое окрашивание позволяет выявить
детали строения микроорганизмов (споры, запасные питательные вещества и т. д.)
и провести их дифференциацию (различить бактерии, сходные по внешнему виду, но
принадлежащие к разным видам.) Окраска спор бактерий производится с применением
притравы (кислот, щелочей) для разрыхления оболочки спор, что облегчает
проникновение в них краски.

Независимо
от того, каким способом будет вестись окраска микроорганизмов, предварительно
надо приготовить, высушить и зафиксировать мазок. Фиксацию надо проводить для того,
чтобы закрепить микроорганизмы на стекле. Только в этом случае микроорганизмы
хорошо окрасятся, при окрашивании останутся на стекле и не будут смыты водой.

Ход
работы:

1.    
Приготовить препараты.

На
середину чистого предметного стекла наносят каплю воды. В нее вводят немного
бактерий, взятых с плотной питательной среды кончиком стерильной
бактериологической иглы. Тщательно перемешивают петлей полученную суспензию
(она должна быть слабомутной) и равномерно распределяют (размазывают) ее тонким
слоем по поверхности предметного стекла на площади 2−3 см2.

Полученный
мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе или (для ускорения) в токе
теплого воздуха пламенем спиртовки, не допуская перегрева стекла (стекло надо
держать мазком вверх). После этого мазок фиксируют, для чего стекло с сухим
мазком проводят 3−4 раза над пламенем спиртовки, прикасаясь к нему той
стороной, где мазок отсутствует. Мазки бактерий можно фиксировать этиловым
спиртом, смесью этилового спирта и эфира, а также другими веществами
(фиксаторами).

2.Окрасить
препараты.

    
2.1. Окраска простым способом.

На
охлажденный фиксированный мазок наносят на 20–40 с 2–3 капли карболового
фуксина Циля, после чего краску смывают водой из промывалки. Промывание
заканчивают, когда вода станет бесцветной. Промытый препарат просушивают на воздухе.
Для более быстрого высыхания нижнюю часть стекла и края, на которых нет препарата,
можно промокнуть фильтровальной бумагой.

    
2.2. Окраска спор бактерий.

Для
окраски спор готовят мазок бактерий так, как описано в п. 2.1, но не фиксируют
его.

   
 2.2.1. На сухой мазок наносят 1–2 капли 0,5%-ного раствора соляной кислоты и
нагревают его в течение 1–2 мин над пламенем спиртовки (до выделения  паров).

    
2.2.2. Остатки кислоты сливают, мазок промывают водой, высушивают на воздухе и
фиксируют в пламени спиртовки (как указано в п. 4.1).

    
2.2.3. На охлажденный фиксированный мазок наносят 1–2 капли фуксина Циля и нагревают
над пламенем спиртовки до появления пара. При этом необходимо следить, чтобы
раствор краски не подсох.

    
2.2.4. Краситель смывают водой и погружают препарат в стаканчик с 5%-ным
раствором серной кислоты на 20–40 с, после чего его сразу же промывают водой.
При погружении в кислоту протоплазма клеток обесцвечивается, а споры остаются окрашенными.

   
2.2.5. На промытый препарат наносят на 3–5 мин метиленовую синь Лефлера (2–3 капли),
после чего препарат тщательно промывают водой и высушивают.

При
этом способе окраски споры окрашиваются в красный цвет, а клетки – в голубой.

   
3. Окрасить бактерии по методу Грама.

 Сущность
метода заключается в том, что бактерии последовательно окрашиваются красителем
генцианвиолетом и йодом, а затем обрабатываются спиртом. При этом одни бактерии
– грамположительные – остаются окрашенными, а другие – грамотрицательные –
обесцвечиваются. Это связано с тем, что у грамположительных бактерий образовавшееся
окрашенное соединение при обработке спиртом удерживается в протоплазме клетки,
а у грамотрицательных оно вымывается из клетки.

   
Приготовить мазок так, как указано в п. 1.

   
3.1. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, наносят на
нее в том месте, под которым находится мазок, 3–4 капли раствора
генцианвиолета, и при помощи пинцета разглаживая бумагу, плотно прижимают к
стеклу. Через 2 мин бумагу снимают, а излишки краски смывают водой.

   
3.2. На мазок наносят 3–4 капли раствора Люголя (раствор йода в йодистом калии)
и по истечении 2 мин сливают его.

   
3.3. Препарат погружают в стаканчик с 96%-ным спиртом на 30–40 с и сразу же
после этого промывают водой.

   
3.4. На препарат наносят на 2 мин разбавленный раствор фуксина. После этого
промывают его водой и просушивают.

 При
данном способе окраски грамположительные бактерии будут фиолетовыми, а грамотрицательные
– красными, так как после обесцвечивания спиртом они окрашиваются фуксином.

Внимание!
При недостаточной обработке мазка спиртом все клетки сохраняют свою окраску, а
при избыточной все обесцвечиваются.

2.    
Микроскопировать окрашенные препараты.

Все
окрашенные препараты последовательно микроскопируют сначала с объективом 8х или
10х, а затем наносят на них каплю иммерсионного масла и микроскопируют с
объективом 90х или 100х. Увиденное в микроскоп при большом увеличении (объектив
90х или 100х) зарисовывают в тетради. Делают выводы о наличии у разных микроорганизмов
спор и об их отношении к окраске по Граму.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА №6

Строение
плесневых грибов и дрожжей

Цель
работы:

Изучить
морфологию плесневых грибов и дрожжей и научиться определять по ключу
принадлежность грибов.

Материалы
и оборудование: предметное стекло, покровное стекло,
микроскоп, р-р Люголя, судан III,
этиловый спирт, иглы, питательные среды с выращенными микроорганизмами.

Теоретическая
часть

Дрожжи
являются одноклеточными неподвижными организмами. Клетки дрожжей могут иметь
округлую, овальную, элипсоидальную или цилиндрическую форму. Длина клеток
колеблется от 5–6 до 10–15 мкм, а ширина – от 2 до 5 мкм. Форма и размеры
дрожжей изменяются в зависимости от условий.

Дрожжи
относятся к истинно ядерным организмам. Их клетка снаружи покрыта оболочкой,
внутри которой находится цитоплазма с различными органоидами и ядро. В
цитоплазме находятся запасные питательные вещества (гликоген, волютин, капли
жира) и заполненные клеточной жидкостью вакуоли.

Наиболее
характерным способом размножения у дрожжей является почкование. Этому
предшествует деление ядра. Затем на материнской клетке образуется небольшая
выпуклость (иногда их может быть несколько) – почка, в которую переходит одно
ядро с частью цитоплазмы и органоидами, после чего почка отшнуровывается от
клетки. Иногда почки, еще не отделившись, в свою очередь начинают почковаться,
образуют скопление дрожжевых клеток – сростки почкования.

Истинным
дрожжам свойственно размножение при помощи спорообразования. Споры у дрожжей
обычно возникают бесполым путем. Образующиеся споры находятся в клетке как в
сумке (аскоспоры). Количество спор в одной дрожжевой клетке колеблется от 1 до
12, но чаще всего бывает 4 споры.

Некоторые
дрожжи могут размножаться простым делением пополам. При этом посредине клетки
образуется перегородка, в результате чего клетка делится на две обычно равные
части.

Дрожжи
широко используются в пищевой промышленности (хлебопечении, молочной
промышленности и др.).

Плесневые
грибы. Строение плесневых грибов более сложное, чем дрожжей. У них различают
клетку гриба и его тело. Клетка гриба по своему строению похожа на растительные
клетки, только лишена хлорофилла. Тело состоит из тонких (5–15 мкм) длинных
нитей – гифов. Гифы ветвятся и переплетаются, образуя тело гриба, которое
называется мицелием.

Гифы
растут своей вершиной или концами разветвлений. Снаружи гифы покрыты оболочкой.
В состав оболочки некоторых грибов входит хитин. Внутри гифа находится
цитоплазма с органоидами и одним или несколькими ядрами. Среди грибов распростронена
многоядерность клеток.

Среди
грибов встречаются как одноклеточные, так и многоклеточные. У одноклеточных
гифы не имеют поперечных перегородок и мицелий представляет собой одну клетку
(несептированный мицелий). У многоклеточных грибов гифы разделены поперечными
перегородками на отдельные клетки (септированный мицелий). Часть мицелия обычно
развивается в субстрате, а часть – на поверхности, образуя воздушный мицелий.
На воздушном мицелии образуются особые гифы, несущие споры.

Отличительной
особенностью грибов является разнообразие способов размножения. У большинства
грибов любая часть мицелия может дать начало новому грибу. Но наиболее
распространенным способом размножения грибов является спорообразование. При
этом споры могут образовываться как бесполым, так и половым путем. При половом
размножении спорообразованию предшествует половой процесс – слияние двух
клеток.

При
бесполом процессе спорообразования споры чаще всего образуются на особых гифах,
отличающихся строением и положением от других гифов мицелия, реже – прямо на мицелии.

У
одних грибов споры образуются на вершине гифов снаружи (экзоспоры). Такие споры
называются конидиями. Они могут находиться или на особых гифах – конидиеносцах,
или прямо на мицелии. Конидии могут располагаться как непосредственно на
верхушке конидиеносцев, так и на особых клетках –стеригмах, покрывающих
верхушку конидиеносцев. Конидии могут располагаться поодиночке, образовывать
цепочки и т. д.

У
других грибов споры образуются внутри особой клетки на конце гифа (эндоспоры).
Эти клетки называется спорангием. Гиф, на котором расположены спорангии,
называется спорангиеносцем. От гифа спорангий отделен перегородкой. Внутри
спорангия образуется большое количество спор.

Они
называются спорангиеспорами.

Спорангиеспоры
образуются путем расщепления многоядерной цитоплазмы молодого спорангия на
отдельные части. У некоторых грибов в спорангиях образуются подвижные споры – зооспоры.

При
полом размножении спорообразованию предшествует половой процесс, при котором
две клетки соединяются и образуют одну – зиготу. У низших грибов редукционное
деление наступает сразу после слияния клеток, поэтому диплоидной является
только зигота.

У
высших грибов ядра двух соединившихся клеток могут не сливаться длительное время.
В результате этого возникают двуядерные клетки – дикарионы, которые могут
многократно делиться. Затем происходит слияние ядер отцовского и материнского
организмов. После этого наступает редукционное деление и образуются гаплоидные
споры. Таким образом, у грибов, в отличие от высших организмов, клетки гаплоидные,
а диплоидная фаза непродолжительна.

Один
и тот же гриб может размножаться и бесполым, и половым путем. Происходит чередование
способов размножения, при этом половое обычно наступает при недостатке питания.
Способы и органы размножения грибов характерны для каждого вида, по-этому
именно они положены в основу классификации грибов.

Для
жизнедеятельности грибов нужны готовые органические вещества и кислород, так
как они являются аэробными организмами. Отличительной особенностью грибов
является то, что они способны развиваться при очень низкой влажности (до
11–13%).

Ход
работы:

1.
Изучить морфологию дрожжей.

1.1.
Приготовить препарат дрожжей типа «раздавленная капля». Для этого на предметное
стекло нанести каплю суспензии дрожжей и осторожно накрыть покровным стеклом.
Препарат типа «раздавленная капля» быстро высыхает, поэтому его микроскопирование
следует проводить сразу же после приготовления.

1.2.
Промикроскопировать препарат дрожжей сначала на увеличении 8х или 10х, а затем
на увеличении 20х или 40х.

Рассмотреть
и зарисовать форму клеток дрожжей и их строение, выявив оболочку, цитоплазму,
вакуоли и включения запасных питательных веществ. Цитоплазма под микроскопом
видна как более темная зернистая масса, гликоген выявляется при виде плотных
темных зерен, вакуоли – при виде светлых прозрачных пятнышек, капли жира – при
виде светлых и блестящих пятнышек, так как они сильно преломляют свет.

   
Убедиться в том, что дрожжи не могут активно двигаться, поскольку не обладают специальными
органами передвижения – жгутиками. Для них характерно только пассивное броуновское
движение с током жидкости, которым обладают все

взвешенные
частицы. В отличие от него активное движение имеет различные характер и
направление.

1.3.
Установить химическую природу внутриклеточных включений. Для этого применяют
микрохимические реакции. Для определения гликогена к капле дрожжей добавляют
каплю раствора Люголя. Препарат закрывают покровным стеклом и микроскопируют с
увеличением 20х или 40х. Наблюдают зерна гликогена, который окрасился в красно-бурый
цвет. Надо учитывать, что в молодых и старых клетках дрожжей содержание гликогена
обычно очень мало.

Для
определения жира к капле дрожжей добавляют каплю 0,5%-ного спиртового раствора
краски судан-III. Препарат закрывают покровным стеклом и микроскопируют с
увеличением 20х или 40х. Наблюдают капли жира, который окрасился в красно-желтый
цвет.

 
1.4. Найти и зарисовать почкующуюся клетку.

  
2. Изучить морфологию плесневых грибов и по ключу определить их вид.

  
2.1. Приготовить препарат плесневых грибов типа «раздавленная капля». Для этого
на чистое, обезжиренное предметное стекло наносят каплю этилового спирта или
смеси равных объемов этилового спирта и глицерина. Двумя препаровальными иглами
берут небольшой кусочек воздушного мицелия плесневого гриба так, чтобы на нем
обязательно были органы размножения (конидии или спорангии), и помещают в
приготовленную каплю. Иглой осторожно расправляют гифы, стараясь не повредить
мицелий и особенно органы размножения. После этого накрывают препарат покровным
стеклом. Старые культуры для исследования брать не рекомендуется, так как при
приготовлении из них препарата органы размножения легко разрушаются.

2.2.
Промикроскопировать препарат плесневых грибов.

Сначала
его рассматривают при увеличении объектива 8х или 10х, затем при увеличении
20х. Найти органы размножения грибов и определить, что это: конидии или
спорангии. Затем найти гифы, на которых они находятся, определить их вид и  расположение
на мицелии и относительно друг друга.

2.3.
По ключу определить видовое название гриба.

   
Найти на препарате один из признаков, соответствующий первому пункту ключа, и в
соответствии с ним переходить к следующему, на который указывает цифра, стоящая
в конце предложения. Например, если при микроскопировании установлено, что
грибы размножаются спорангиоспорами, находящимися внутри спорангиев, то
переходят к пункту 2. На это указывает цифра 2. Если же грибы размножаются
конидиями, образующимися снаружи на особых конидиеносцах, реже прямо на
мицелии, то переходят к пункту 5.

Микроскопирование
препарата в соответствии с пунктами ключа продолжают до тех

пор,
пока не придут к родовому названию гриба.

2.4.
Записать в тетради все пункты ключа, которые проходили при определении
названия.

2.5.
Зарисовать в тетрадь все признаки, увиденные под микроскопом, по которым определено
видовое название гриба, и дать к ним пояснения.

Приложение
2.

Ключ
к определению родового названия грибов

1.
Грибы размножаются спорангиоспорами, находящимися внутри спорангиев – 2. Грибы
размножаются конидиями, образующимися снаружи на особых конидиеносцах, реже
прямо на мицелии – 5.

   
2. Спорангиеносцы, несущие спорангии, обычно простые, реже – просто ветвящиеся.
Спорангии все одинаковые – 3.

    
Спорангиеносцы ветвящиеся. Спорангии двух видов: крупные – на главной оси и
мелкие (спорангиоли) – на боковых ветвях – 4.

    
3. Спорангиеносцы одиночные, простые, иногда ветвящиеся. Спорангии мелкие или крупные,
всегда однородные, бесцветные или окрашенные. Споры округлые или эллипсоидальные,
гладкие бесцветные или сероватые. – Мукор.

    
Спорангиеносцы расположены кустиками, вырастающими на стлонах из одного центра,
с большими черными головками.

Споры
округлые, яйцевидные, морщинистые. – Ризопус.

    
4. Кустовидные ветви расположены мутовчато на главной оси спорангиеносца в один
или несколько ярусов. Места ответвления нераздуты. Споры цилиндрические и
эллипсоидальные, бесцветные. – Тамнидиум.

    
Кустовидные ветви отходят от вздутий на главной оси спорангиеносца. Ветви
второго порядка также отходят от вздутых мест.

Спорангиоли
сидят на вздутиях мелких конечных ветвей. Споры эллипсоидальные или шаровидные,
бесцветные. – Хетостилум.

    
5. Конидии образуются на особых конидиеносцах, отличных от обыкновенных вегетативных
гифов – 6.

    
Конидиеносцы или мало отличаются от обыкновенных гифов, или их нет вовсе, и
конидии образуются прямо на мицелии – 14.

    
6. Конидиеносцы обильно ветвятся различным образом – 7.

    
Конидиеносцы не ветвятся или иногда ветвятся, но слабо. Ветвление простое,
вильчатое или кустообразное – 9.

    
7. Ветвление древовидное – 8.

    
Ветвление кистевидное или многократновильчатое, конидии располагаются цепочками,
гладкие, бесцветные или окрашенные, округлые. – Пенициллиум.

    
8. Конидиеносцы древовидно-разветвленные, большие. Ветви располагаются
беспорядочно, конидии на концах ветвей развиваются кустиками, бесцветные,
яйцевидные, гладкие. – Ботритис.

    
Конидиеносцы древовидно-разветвленные. Ветви располагаются мутовчато. Конидии
образуются пачками или поодиночке, вытянуто-яйцевидные или эллипсоидальные,
бесцветные или слабоокрашенные. – Вертициллиум.

    
9. Конидиеносцы неветвящиеся, длинные, с кустиками больших грушевидных конидий
на конце. Конидии двуклеточные, бесцветные или розоватые. Колонии гриба
желтоваторозовые. – Трихотециум.

    
Конидиеносцы и конидии иной формы – 10.

    
10. Конидиеносцы ветвятся. Ветвление простое, реже – вильчатое – 11.

   
 Простые (как исключение, просто ветвящиеся) конидиеносцы имеют на конце булавовидное
или пузыревидное вздутие. Иногда такое вздутие отсутствует – 12.

    
11. Конидии крупные, неправильной формы, усеяны бородавочками, расположены
цепочками, окрашены в коричневый цвет. Колонии вначале пушистые, потом
слизистые, с сильным неприятным запахом мышьяковистого водорода. – Акаулиум.

    
Конидии бесцветные, длинные, серпообразные, многоклеточные (с поперечными перегородками),
иногда расположены цепочкой одна за другой или появляются прямо на мицелии. Дерновинки
гриба окрашены в розовый цвет (особенно нижняя сторона). – Фузариум.

    
12. Концы конидиеносцев булавовидно или пузыревидно раздуты и покрыты
стеригмами, несущими цепочки конидий – 13.

    
Расширение на конце часто отсутствует, стеригмы располагаются только на вершине
конидиеносцев, но не растут по сторонам. Конидии мелкие, округлые, гладкие,
бесцветные, на стеригмах располагаются цепочками. – Цитромицес.

    
13. Стеригмы, покрывающие булавовидные вздутия, простые, неветвящиеся, несут
цепочки конидий. Конидии округлые, гладкие или шиповатые, окрашенные или
бесцветные. – Аспергиллус.

    
Стеригмы ветвящиеся, образуют на пузыревидном вздутии конидиеносца два яруса.
Верхний несет цепочки конидий. Конидии округлые, гладкие, окрашенные. –
Стеригматостис.

    
14. Конидии образуются прямо на мицелии – 16.

    
Конидии образуются на конидиеносцах, мало отличающихся от обыкновенных
вегетативных гифов – 15.

    
15. Конидиеносцы видны лишь при культуре «висячая капля». Конидии легко
рассыпаются – 17.

    
Места образования конидий видны в обычном микроскопическом препарате – 18.

   
16. Одноклеточные конидии, бесцветные, веретеновидные или  округло-удлиненные.
Конидии слизистые, черные. – Дематиум. Конидии одноклеточные, яйцевидные,
дрожжеобразные. Молодые колонии похожи на дрожжевые, потом становятся лохматыми.
– Монилия.

   
17. Конидии получаются простым делением мицелия и легко отпадают, бесцветные, прямоугольные,
иногда соединены в короткие цепочки. – Оидиум.

 
  Конидиеносцы длинные, многоклеточные. Конидии неправильной формы (длинные, округлые
или лимонообразные), окрашены в светлый оливково-зеленый цвет. – Кладоспориум.

   
18. На медленно растущих колониях нет настоящих конидиеносцев. Мелкие,
блестящие, желто-коричневые конидии образуются очень длинными цепочками на
концах обыкновенных гифов. – Катенулария.

   
Крупные, многоклеточные, округло-грушевидной или заостренно-вытянутой формы
конидии образуются в одиночку или короткими цепочками на коротких боковых ветвях
вегетативных гифов, играющих роль конидиеносцев. – Альтернария.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7

МИКРООРГАНИЗМЫ ВРЕД или ПОЛЬЗА?!

Цель работы:

Изучить способы определения бактерий;

Познакомиться с полезными и вредными свойствами
бактерий;

Обосновать необходимость гигиенических
процедур.

Материалы и оборудование: чашки Петри 4 шт, питательная среда Чапека,
шпатели, игла, молоко, монета, парафильм или пищевая пленка, марлевые повязки,
перчатки

Ход работы:

1.    
Приготовить питательную среду
и разлить ее по чашкам Петри,

2.    
В чашку Петри №1 капнуть каплю
молока

3.    
В чашке Петри №2 оставить
отпечаток не мытых рук

4.    
В чашке Петри №3 оставить
отпечаток помытых рук

5.    
В чашке Петри №4 слегка дотронуться
монеткой до питательной среды

6.    
Наблюдать за ростом
микроорганизмов

7.    
Сделать выводы.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 8

Влияние
факторов внешней среды на развитие микроорганизмов

Цель
работы:

Изучить
влияние факторов внешней среды (рН среды, температуры и концентрации) на
развитие микроорганизмов.

Задачи:

  
Занятие 1

   
1. Сделать посев бактерий на питательных средах с различным значением рН.

   
2. Сделать посев бактерий на питательных средах с различной концентрацией
хлорида натрия.

   
3. Воздействовать на спорообразующие и неспорообразующие бактерии высокой
температурой и сделать их посевы.

   
4. Сделать посевы плесневых грибов на питательных средах и вырастить их при
различных температурах.

   
5. Сделать посев плесневых грибов или дрожжей на питательных средах с различной
концентрацией глюкозы.

Занятие
2

   
6. Провести оценку интенсивности роста бактерий на питательных средах с
различным значением рН.

   
7. Провести оценку интенсивности роста бактерий на питательных средах с
различной концентрацией хлорида натрия.

   
8. Провести оценку интенсивности роста бактерий после воздействия на них
высокой температуры.

   
9. Из выросших культур приготовить мазки и окрасить их по Граму.

   
10. Промикроскопировать препарат и установить форму бактерий.

   
11. Провести оценку интенсивности роста и спорообразования плесневого гриба при
различных температурах выращивания.

   
12. Провести оценку интенсивности роста плесневого гриба или дрожжей на питательных
средах с различной концентрацией глюкозы.

   
13. Определить по ключу родовое название изучаемого плесневого гриба.

Материалы
и оборудование: Стерильные пробирки, термостат,
микроскоп, водяная баня, пипетки Пастера, штатив, сухое горючее, 60%р-р
глюкозы, 5%,10%, 20%р-ры хлорида натрия, рН метр, чашки Петри, питательная
среда.

Теоретическая
часть

В
естественных условиях микроорганизмы подвергаются воздействию разных по своей
природе факторов, которые могут как стимулировать, так и тормозить их развитие
(замедлять метаболические процессы) и даже приводить их к гибели.

Температура
является одним из наиболее мощных факторов, воздействующих на микроорганизмы. И
хотя в целом развитие микроорганизмов происходит в очень широком диапазоне температур,
для каждого конкретного вида существуют определенные температурные границы, в
которых происходит их жизнедеятельность. Эта температурная зависимость
характеризуется тремя точками:

   
– минимальной температурой развития (t minimum). Это такая температура, при
незначительном снижении которой скорость роста стремится к нулю (V роста → 0);

   
– оптимальной температурой развития (t optimum). Это такая температура, при
которой скорость роста является максимальной (V роста = mах);

   
– максимальной температурой развития (t maхimum). Это такая температура, при незначительном
увеличении которой скорость роста стремится к нулю (V роста → 0).

 В
зависимости от отношения к той или иной температуре все микроорганизмы делятся на
три основные группы: психрофилы, мезофилы и термофилы.

Психрофилы
(греческое «психрос» – холод, «филео» – люблю) развиваются при низких
температурах. Минимальной температурой развития у них является температура
замерзания среды (около – 2 °С), оптимальная – 15…20 °С, а максимальная – 30…35
°С. К ним относятся обитатели холодных источников северных морей и океанов. Их
часто обнаруживают на поверхности рыб. Многие из них, относящиеся к родам
Рseudomonas, Аchromobacter, способны быстро вызывать микробиальную порчу рыбы,
хранящейся при температуре 0 °С. К психрофилам относится большинство светящихся
бактерий рода Photobacterium. Их развитие в морской воде вызывает ее свечение.

Мезофилы
(«мезос» – средний) – наиболее распространенная группа микроорганизмов,
развивающихся в температурных пределах от 5–10 до 40–50 °С. Температурный
оптимум для них составляет 25–30 °С. К этой группе относятся многие гнилостные
бактерии, вызывающие порчу пищевых продуктов при положительных температурах, а
также все патогенные и токсичные формы бактерий. Вместе с тем большинство
промышленных процессов (получение органических кислот, ферментов и т. д.) осуществляется
с помощью мезофилов.

Термофилы
(«термос» – теплый) развиваются в температурных пределах от 30–35 до + 80 и
даже до + 90 °С с оптимумом 50–60 °С. Они присутствуют в почве, навозе, иле.
Среди них есть как споровые, так и неспоровые бактерии. Наибольшее количество
термофилов наблюдается в местах, постоянно испытывающих действие высоких
температур (например, в горячих источниках).

Термофилия
широко распространена среди анаэробов. В большинстве это споровые формы
(например, представители рода Clostridium), причем споры у них отличаются
особой термоустойчивостью. Поэтому они могут переносить стерилизацию и вызывать
плоско-кислую порчу консервов.

Отрицательное
воздействие на микроорганизмы оказывают как низкие, так и высокие температуры,
но механизм их действия различен. Низкие температуры оказывают в основном бактериостатическое
действие вследствие замедления протекания биохимических процессов (замедления
метаболизма).

Гибель
микроорганизмов (бактерицидное действие) наблюдается в случае чисто механического
разрыва клеток образующимися в них кристаллами льда. Чем меньше образующиеся кристаллы
льда и чем равномернее они распределены в клетке, тем меньше гибель микроорганизмов.
И наоборот, чем крупнее кристаллы, тем больше клеток погибнет. Поэтому наиболее
губительны для микроорганизмов температуры, которые соответствуют
криоскопической точке цитоплазмы (от – 2 до – 5,6 °С).

Чем
дальше температура отстоит от криоскопического значения, тем меньше гибель
микроорганизмов.

Наиболее
губительны для микроорганизмов высокие температуры. Повышение температуры
приводит к ускорению биохимических реакций, но скорость реакций в клетке изменяется
непропорционально, что приводит к дисбалансу и нарушению протекания
метаболических процессов.

Высокие
температуры (70–80 °С и выше) оказывают бактерицидное действие. Под их
воздействием происходит денатурация белка, приводящая к нарушению проницаемости
клеточных стенок, потере активности ферментов, изменению структуры цитоплазмы
и, как следствие всего этого, гибели клетки.

Разные
группы микроорганизмов проявляют разную чувствительность к действию высоких и
низких температур. Наиболее чувствительны к действию низких температур
термофилы и мезофилы, а к действию высоких – психрофилы и мезофилы.  Наибольшей
устойчивостью к действию высоких температур обладают споры. Воздействие высоких
температур широко используется для подавления развития микроорганизмов.

Реакция
среды рН определяется концентрацией ионов водорода. Хотя в целом микроорганизмы
развиваются в очень широком диапазоне рН, каждой физиологической группе и даже
отдельным видам соответствуют определенные значения рН (оптимальная зона рН), в
пределах которых происходит их развитие. Плесневые грибы, дрожжи и бактерии
рода Acetobacter лучше всего развиваются в кислой среде при рН = 3–5. Такие
микроорганизмы называются ацидофильными.

Для
большинства бактерий наиболее благоприятна нейтральная или слабощелочная среда
с оптимумом рН 7,0–7,3. Изменение рН в кислую сторону губительно отражается на
гнилостных бактериях. Наоборот, уксуснокислые бактерии к кислой среде
устойчивы.

Особенно
чувствительны к изменению реакции среды азотфиксирующие бактерии, в частности
азотобактер. Он лучше всего развивается при рН 7,4–7,6, поэтому в кислых почвах
его практически нет. Клубеньковые бактерии тоже лучше развиваются при
слабощелочной реакции среды, хотя зона рН, при которой они могут развиваться,
значительно шире, чем у азотобактера.

Влияние
рН на развитие микроорганизмов основано на том, что реакция среды влияет на
активность ферментов, так как каждый фермент проявляет свою активность только
при определенных значениях рН. От концентрации ионов водорода зависит также
поступление питательных веществ внутрь клетки и физическое состояние белков.
Так, денатурация и выпадение большинства белков в осадок под действием высоких
температур наиболее быстро и полно происходит в слабокислой среде. Увеличение
кислотности среды наряду с температурой

широко
используется для подавления развития микроорганизмов при консервировании
пищевых продуктов.

Ход
работы:

   
Занятие 1

1.    
Провести посев бактерий на питательные среды
с различным значением рН.

Посев
проводят в четыре пробирки на МПА (агар) с различным значением рН: в одной из
них рН равно 3, во второй – 5, в третьей – 7 и в четвертой – 9. Перед началом
посева каждую пробирку подписывают: указывают значение рН и ставят свой номер.

Для
посева используют бактерии или из чистой бульонной культуры, или из плотной
питательной среды. Посев производят бактериальной петлей или бактериальной
иглой с соблюдением правил асептики. При посеве на плотную среду пользуются
иглой, а на жидкую – петлей.

Петлю
или иглу стерилизуют перед каждым посевом в пламени сухого горючего (фламбирование).
После посева пробирки с засеянными средами помещают в штатив и ставят в
термостат.

Термостатирование
проводят в течение 24–48 ч при температуре  37 °С. После этого выращенные
культуры микроорганизмов переставляют в холодильник и хранят там до следующего
занятия.

2.    
Провести посев бактерий на питательные
среды с различной концентрацией хлорида натрия.

Посев
проводят в четыре пробирки напитательную среду с различной концентрацией
хлорида натрия: 5, 10, 20% и без него (контрольный посев). Все пробирки предварительно
подписывают и нумеруют. Посевы проводят бактериальной петлей, которую каждый
раз стерилизуют в пламени спиртовки.

Пробирки
с засеянными средами помещают в штатив и ставят в термостат. Посевы термостатируют
в течение 24 ч при температуре 37 °С. После этого выращенные культуры переставляют
в холодильник и хранят там до следующего занятия.

3.    
Провести посев бактерий на косой агар
после воздействия на них высокой температуры.

Сначала
готовят взвеси из культур бактерий, образующих и не образующих споры. Для этого
берут две пробирки со стерильным изотоническим раствором. В одну вносят
культуру сенной палочки (образует споры), а во вторую – молочнокислого
стрептококка (не образует споры). Обе пробирки помещают в кипящую водяную баню
на 10 мин. После кипячения пробирки охлаждают и из каждой делают посев при
помощи петли на косой агар. Перед каждым посевом петлю стерилизуют.

Пробирки
с посевами подписывают, указав культуру, которая в них посеяна, и свой номер,
помещают в штатив и ставят в термостат. Посевы термостатируют 24 ч при
температуре 37 °С.

После
этого выращенные культуры переставляют в холодильник и хранят там до следующего
занятия.

4.    
Провести выращивание плесневых грибов при
различных температурах.

Посеять
споры плесневого гриба в три чашки Петри на сусло-агар (СА) или среду Сабуро с
агаром. Предварительно готовят водяную суспензию спор. Для этого берут культуру
плесневого гриба со зрелыми органами размножения (конидиями или спорангиями) и
проводят по ним бактериальной петлей, предварительно смоченной в воде (чтобы
споры лучше к ней прилипали). Затем вносят петлю в стаканчик или пробирку с
водой (перенося туда споры) и тщательно перемешивают.

Переносить
споры в пробирку можно несколько раз.

После
этого стерильной бактериальной петлей берут каплю водяной суспензии спор плесневого
гриба и осторожно наносят ее на СА, прикасаясь ребром петли в центр каждой
чашки.

При
повторных посевах петлю можно не стерилизовать. Все чашки необходимо подписать,
указав на каждой из них температуру выращивания, и поставить свой номер. Все
надписи делаются только на дне чашек.

Засеянные
чашки переворачивают вверх дном и ставят посевы на выращивание. Выращивание
микроорганизмов при температурах 5 °С проводят в холодильнике, а при
температуре 25 °С – в комнатных условиях, недалеко от батарей центрального
отопления (при этом чашки надо накрыть темным материалом, чтобы на них не
попадал свет), при 40 °С – в термостате. Через 48–72 ч все чашки переставляют в
холодильник и хранят там до следующего занятия.

   
4.5. Провести посев плесневых грибов или дрожжей на питательные среды с различной
концентрацией глюкозы.

Посев
проводят в четыре пробирки на пивное сусло или среду Сабуро с 20, 40 и 60%-ой
концентрацией глюкозы и без нее (контрольный опыт). Все пробирки предварительно
подписывают, указав концентрацию глюкозы и поставив свой номер.

Для
посева используют суспензию спор плесневого гриба, приготовленную для предыдущего
опыта. Кроме этого, готовят суспензию дрожжей. Для этого небольшое количество
сухих дрожжей помещают в стаканчик или пробирку с водой и тщательно
перемешивают. Посевы проводят стерильной бактериальной петлей или
микропипеткой.

Пробирки
с засеянными средами ставят в штатив и помещают в термостат, где их термостатируют
в течение 48 ч при температуре 25 °С. В случае необходимости можно на это же время
оставить пробирки на столике вблизи батареи центрального отопления. При этом
предварительно они должны быть тщательно закрыты плотным темным материалом, не
пропускающим свет. Через двое суток выращенные культуры переставляют в
холодильник и хранят там до следующего занятия.

Занятие
2

Выполненные
на предыдущем занятии посевы достают из холодильника и проводят их анализ.

1.
Провести оценку роста бактерий на средах с различными значениями рН.

Интенсивность
роста бактерий на средах с различными значениями рН определяется по степени мутности
среды. Перед этим содержимое каждой пробирки, на которой был проведен посев на
предыдущем занятии, тщательно перемешивают (вращая пробирки между ладонями) и
затем сравнивают друг с другом.

2.Провести
оценку роста бактерий на средах с различной концентрацией NaCl и без нее.

Интенсивность
роста бактерий, как и в предыдущем опыте, определяется по степени мутности
среды. Для ее проведения содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают и
сравнивают его с содержимым других пробирок, определяя степень мутности,
которая оценивается визуально и обозначается следующим образом: отсутствие
роста (–); слабый рост (+); умеренный рост (++); обильный рост (+++).

3.Провести
оценку роста бактерий после воздействие на них высокой температуры.

Действие
высоких температур на спорообразующие и неспорообразующие бактерии определяют
по характеру роста микроорганизмов на косом агаре (сплошной, в виде отдельных
колоний или обильный, слабый, умеренный, отсутствие роста).

4.
Приготовить мазки, окрасить их по Граму и промикроскопировать.

Для
распознавания изучаемых бактерий (микрококки, сарцины, бациллы или неспороносные
палочки) из двух пробирок с рН 7 и нулевой концентрацией соли готовят мазки,
высушивают и фиксируют их, а затем окрашивают по Граму и микроскопируют с
увеличением объектива 90х или 100х. Увиденное под микроскопом зарисовывают в
тетрадь и формулируют выводы.

 5.
Провести оценку роста плесневого гриба, растущего при разных температурах.

Показателями
влияния температуры на рост плесневых грибов служат величина колоний и
интенсивность их спороношения. Для определения этих показателей чашки Петри, на
которых росли грибы, переворачивают и со стороны дна чашки измеряют при помощи
линейки диаметр  выросших при разной температуре колоний. Полученные результаты
записывают в табл. 4 и делают выводы.

Для
оценки интенсивности спороношения, как и в предыдущих опытах, пользуются
следующими условными обозначениями: спороношение отсутствует (–); спороношение
слабое (+); спороношение умеренное (++); спороношение сильное, или обильное
(+++). Полученные данные заносят в табл. 4 и делают выводы о влиянии различных
температур на рост и спороношение плесневого гриба.                               

5.    
Определить родовое название гриба

Для
определения родового названия выросшего гриба готовят препарат типа
«раздавленная капля» и микроскопируют его. Препарат готовят обычным способом.

Внимание!
Для того чтобы органы размножения грибов не нарушились и споры не осыпались,
кусочек мицелия берут  очень аккуратно на границе участка с заметным
спороношением.

Приготовленный
препарат микроскопируют на увеличение объектива 10х. При микроскопировании надо
найти и зарисовать органы размножения гриба и по ключу определить его родовое
название.

6.                
Провести оценку роста плесневого гриба и
дрожжей, растущих при различной концентрации глюкозы.

Влияние концентрации глюкозы
в среде на рост плесневого гриба определяют по интенсивности развития мицелия и
спорообразования. Для этого просматривают пробирки с посевами, сделанными на
предыдущем занятии, и сравнивают их друг с другом. При сравнении полученных
результатов пользуются условными обозначениями: отсутствие роста или
спорообразования (–); слабый рост или спорообразование (+); умеренный рост или
спорообразование (++); обильный рост или спорообразование (+++). Полученные данные
заносят в табл. 5 и формулируют выводы.

Интенсивность развития
дрожжей на средах с различной концентрацией глюкозы определяется по степени
мутности сусла. Перед определением содержимое каждой пробирки, на котором был
проведен посев на предыдущем занятии, тщательно перемешивают (вращая пробирку
между ладонями) и затем сравнивают ее с содержимым других пробирок.
Интенсивность развития дрожжей по мутности среды характеризуют, используя
указанные выше условные обозначения. Полученные данные заносят в табл. 5 и
делают выводы.

Определение
родового названия изучаемого гриба ведут так, как указано в приложение 2.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 9

Изучение
морфологии дрожжей

Цель
работы:

Ознакомиться с
морфологическими особенностями грибов  и дрожжей, встречающихся при
производстве пищевых продуктов. Освоить  технику  микроскопического
исследования грибов и дрожжей в препаратах «раздавленная капля».

Материалы
и оборудование: Микроскоп; пипетка, шпатели,
препаровальные иглы и бактериологические петли; предметные и покровные стекла;
фильтровальная бумага; спиртовка; поднос для предметных стекол; чистая культура
дрожжей, марлевые повязки, перчатки, парафильм или пищевая пленка.

Теоретическая
часть:

Морфология
дрожжей и их характеристика

Дрожжи – это высшие одноклеточные грибы.
Большинство дрожжей относится к двум классам грибов – аскомицетам и
дейтеромицетам.

Дрожжи по отношению к кислороду делятся на факультативные анаэробы (в
аэробных условиях осуществляют дыхание и активно накапливают биомассу, а в
анаэробных условиях вызывают спиртовое брожение) и  аэробы.

Морфологически дрожжи разнообразны. Они отличаются друг от друга
размерами и формой клеток. Размеры клеток дрожжей в зависимости от вида
варьируют в следующих пределах; от 2,5 до 10 мкм в поперечнике и от 4 до 20 мкм
в длину. Морфологическое разнообразие форм дрожжей  изображено на рис. 6.

Рис.
6  Формы дрожжевых клеток: а — овальная яйцевидная;

б
—  цилиндрическая; в – апикулятная; лимоновидная;  г – стреловидная;

д
– треугольная; е – серповидная; ж – колбовидная; з, и — мицелевидная

Форма и размеры дрожжевых клеток зависят от вида, возраста, питательной
среды, способа культивирования.

В зависимости от вида дрожжи вегетативно могут размножаться почкованием
(так размножаются дрожжи овальной формы), бинарным делением (характерно для
дрожжей цилиндрической или палочковидной формы) или почкующимся делением. Кроме
вегетативного размножения, дрожжи – аскомицеты могут размножаться половым путем
с образованием аскоспор.

Из дрожжей, относящихся к классу аскомицетов, большое значение имеют
дрожжи-сахаромицеты рода Saccharomyces,
которые
широко используются в пищевой промышленности. Главным
биохимическим признаком этих дрожжей является то, что они сбраживают сахара с
образованием этилового спирта и диоксида углерода. Дрожжи, используемые в
промышленности, называются культурными дрожжами. Так, в хлебопекарном
производстве и в производстве спирта используются верховые дрожжи рода Saccharomyces
cerevisiae. Дрожжи вида Saccharomyces
minor нашли применение в
производстве ржаного хлеба и кваса. В пивоварении используются низовые дрожжи Saccharomyces
carlsbergensis. Дрожжи-сахаромицеты
имеют овальную форму, вегетативно размножаются почкованием, в неблагоприятных
условиях размножаются половым путем аскоспорами.

Некоторые спорогенные дрожжи являются дикими дрожжами.
Эти дрожжи так же, как и культурные, способны осуществлять спиртовое брожение,
но помимо спирта образуют много побочных продуктов (таких как альдегиды, высшие
спирты, эфиры и др.) и поэтому ухудшают органолептические показатели продукта.
Эти дрожжи являются вредителями производства различных напитков (пива, вина,
безалкогольных напитков), а также возбудителями порчи многих пищевых продуктов.

Дрожжи — дейтеромицеты могут размножаться только вегетативным способом.
Некоторые из этих дрожжей (например, дрожжи рода Candida)  используются в промышленности для получения кормового белка,
органических кислот, витаминов и других продуктов микробного синтеза. Дрожжи
вида Torulopsis kefir входят в состав симбиотической закваски – кефирного грибка. Другие
представители несовершенных (аспорогенных) дрожжей являются дикими дрожжами и
вызывают  порчу многих пищевых продуктов. К дрожжам- вредителям производства
относятся дрожжи родов Pichia, Hansenula, Candida, Rhodotorula, Torula, Torulopsis, Mycoderma, Trichosporon и др. Среди
аспорогенных дрожжей встречаются ложные дрожжи, которые образуют
псевдомицелий и растут на жидких субстратах в виде пленок.

Ход
работы:

На занятии учащиеся изучают морфологические признаки грибов и дрожжей,
их культуральные свойства, знакомятся с представителями отдельных классов.
Осваивают методику приготовления препаратов «раздавленная капля» и технику 
микроскопирования живых неокрашенных объектов.

Приготовление
препаратов типа «раздавленная капля»

При исследовании дрожжей на предметное стекло
наносят суспензию дрожжей, накрывают покровным стеклом, излишки воды удаляют
фильтровальной бумагой. Микроскопируют препарат и объективом х8 и х40.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА №10

Изучение
культуральных свойств выросших в чашках колоний

Цель работы:

Изучить культуральные свойства выросших колоний

Материалы и оборудование: Чашки Петри, среда Чапека, стерильные шпатели, пипетки,
лупа, штатив, петля, перчатки, марлевые повязки, парафильм или пищевая пленка.

Ход работы:

1)    Вырастить методом Коха колонии микроорганизмов.

2)    Рассмотреть выросшие колонии в проходящем свете
невооруженным глазом (макроскопически) и с помощью лупы описать следующее:

1.    
Форму колоний

Формы колоний, которые могут вырастать на плотной среде в
чашках Петри, изображены на рис. 7.

Рис.7 Форма колоний: а – круглая; б – круглая с
фестончатым краем;

 в – круглая с валиком по краю; г; д – ризоидная; е – с
ризоидным краем;

ж –амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая; к –
неправильная;

л – концентрическая; м – сложная

Форма колоний может быть круглой, неправильной,
корневидной, эллипсовидной и т.д.

2.    
Размеры колоний

Колонии, имеющие диаметр более 4
мм являются крупными, от 2 до 4 мм – средними, от 1 до 2
мм – мелкими, менее 1 мм — точечными или росинчатыми.

3.    
Цвет колоний

Микроорганизмы, содержащие пигменты могут быть желтого,
оранжевого, розового, кремового и др. цветов. Большинство микроорганизмов не
содержат пигментов и растут на плотных средах в виде серовато-матовых колоний.
Такие колонии называют бесцветными.

4.    
Рельеф (профиль) колоний

Рельеф или профиль колоний может быть плоским, выпуклым, куполообразным,
смешанным — плоским с выпуклым центром, кратерообразным и др. (рис. 8).

Рис. 8  Профиль колоний: а – изогнутый; б –
кратерообразный;

в – бугристый; г – врастающий в
агар; д – плоский; е –выпуклый;

ж – каплевидный; з — конусовидный

5.  Поверхность колоний

Поверхность колоний может быть гладкой, блестящей,
шероховатой, морщинистой, извилистой и т.д.

6. Характер края колоний

 Разновидности края колоний  изображены на рис. 9.

Рис.9   Край колоний: а —  гладкий; б – волнистый;
в – зубчатый;

 г – лопастный; д – неправильный; е
– реснитчатый;

ж – нитчатый; з – ворсинчатый; и —
ветвистый

Край может быть ровным (гладким); волнистым; локонообразным
(нитчатым); лопастным; бахромчатым; зазубренным; корневидным (ветвистым) и др.  

7.    
Прозрачность колоний

Колонии бывают прозрачные, полупрозрачные и непрозрачные.

8. Структуру колоний

Структура колоний бывает однородная (гомогенная) и
неоднородная (гетерогенная). Неоднородные колонии могут быть мелко- и
крупнозернистыми, радиально или концентрически исчерченными, чешуйчатыми и др.

9. Консистенцию колоний

Определяется при приготовлении препаратов для
микроскопического анализа.

Сделать выводы

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 11

Выращивание
микроорганизмов

Цель работы:

Вырастить уникальные образцы микроорганизмов

Бактерии увлекательный вид микроорганизмов, которые играют большую
роль в нашей жизни, хотим мы этого или нет. Попробуйте вырастить ваши
собственные образцы бактерий, наблюдая, как они воспроизводятся в короткий
промежуток времени. Сравните ваши оригинальные образцы с другими людьми и
получить доказательства того, что бактерии действительно есть везде!

Материалы и оборудование: Чашки Петри, питательная среда, ватные тампоны, парафильм или
пищевая пленка, марлевые повязки, перчатки

Ход работы:

 1.Приготовьте чашку Петри с небольшим количеством
питательной среды.

 2. Используйте ватный тампон на определенной территории
вашего дома (т.е. необходимо взять образец, протирая ватным тампоном
поверхность по вашему выбору).

 3. Стряхните тампон над чашкой, прежде чем положить крышку
на место и загерметизируйте чашку парафильмом.

 4. Поместите чашку в теплое помещение в течение на 2 или 3
дня.

5.           
Проверяйте рост бактерий
каждый день, делая рисунки, фотографии и описание изменений.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА №12

Выращивание
своих собственных микроорганизмов

Цель работы:

Вырастить уникальные образцы своих собственных микроорганизмов

Бактерии увлекательный вид микроорганизмов, которые играют большую
роль в нашей жизни, хотим мы этого или нет. Попробуйте вырастить ваши
собственные образцы бактерий, наблюдая, как они воспроизводятся в короткий
промежуток времени. Сравните ваши оригинальные образцы с другими людьми и
получить доказательства того, что бактерии действительно есть везде!

Материалы и оборудование: Чашки Петри, питательная среда, ватные тампоны, парафильм или
пищевая пленка, перчатки, марлевая повязка, штатив.

Ход работы:

 1.Приготовьте чашку Петри с небольшим количеством
питательной среды.

 2. Используйте ватный тампон по руке (т.е. необходимо взять
образец, протирая ватным тампоном поверхность по вашему выбору).

 3. Стряхните тампон над чашкой, прежде чем положить крышку
на место и загерметизируйте чашку парафильмом.

 4. Поместите чашку в теплое помещение в течение на 2 или 3 дня.

5.                
Проверяйте рост бактерий
каждый день, делая рисунки, фотографии и описание изменений.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА №13

Определение
чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Цель работы:

Определить чувствительность микроорганизмов к антибиотикам.

Материалы и оборудование: чашка Петри 4шт, питательная среда Чапека, агар, шпатели, иглы,
парафильм или пищевая пленка, антибиотики, марлевые повязки, перчатки.

Практическая часть:

1.    
Приготовить питательную среду
и разлить ее по чашкам Петри, накрыть пленкой до опыта.

2.    
Чашку Петри №1, 2 оставить в
туалете на 15 мин

3.    
В чашке Петри №3, 4 оставить
отпечаток не мытых рук

4.    
Наблюдать за ростом
микроорганизмов

5.    
Чашки № 1, 3 оставить без
изменений и наблюдать за дальнейшим ростом микроорганизмов (контроль)

6.    
В чашках Петри №2, 4 на
колонии бактерий нанести с помощью пипетки антибиотики и оставить для
дальнейшего роста микрооранизмов.

7.    
Сравнить чашки № 1 и №2; №3 и
№4.

8.    
Сделать выводы.

РАЗДЕЛ
ЦИТОЛОГИИ

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 14

Изучение
плазмодесмы в клетках эндосперма хурьмы

Цель работы:

Изучение плазмодесмы в клетках эндосперма хурьмы

Материалы и оборудование: микротом, чашка Петри, предметные и покровные стекла, пинцет,
микроскоп

Ход работы:

Плазмодесмы в оболочках клеток запасающей ткани семени хурмы
(Diospyros Kaki Thunb.) Клетки эндосперма в очертании многоугольные, соединены
плотно, без межклетников. Клетки имеют очень толстые оболочки, между которыми
обычно хорошо заметны межклеточные пластинки. Толщина оболочек обусловлена
мощным отложением в них гемицеллюлозы как вещества запаса. Во многих клетках
видны пересекающие оболочки группы тонких канальцев с плазмодесмами,
соединяющими протопласты соседних клеток.

1.                
Для приготовления препарата пригодны
свежие и хранящиеся в глицерине семена. Сняв кожуру, сделать тонкий поперечный
срез запасающей ткани (эндосперма), положить его в каплю раствора йода в водном
растворе йодида калия

2.                
Накрыть покровным стеклом и
рассмотреть при малом и большом увеличении микроскопа.

3.                
Зарисовать несколько клеток,
на рисунке обозначить содержимое клетки, клеточную стенку плазмодесмы.

4.                
Сделать выводы о плазмодесмах
эндосперма хурьмы

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 15

Молодые
клетки зачатка листа

Цель работы:

Изучить молодые клетки зачатки листа

Материалы и оборудование: микротом, предметное и покровное стекло, микроскоп, лупа, пипетка,
препаровальная игла,

Ход работы:

1.                
Приготовить временный препарат
зачатка листа. Для приготовления препарата верхушку побега (не более 1 см
длиной) положить на предметное стекло в большую каплю воды и осторожно под
микроскопом или лупой двумя препаровальными иглами удалить крупные листья.

2.                
Самые мелкие чешуевидные
листья, скученные на верхушке побега, оторвать от стебля, расправить, накрыть
покровным стеклом и рассмотреть при малом, а затем при большом увеличении
микроскопа.

3.                
Зарисовать молодую и развивающуюся
клетку. Сделать подписи к рисункам.

4.                
Описать различия молодой и
развивающейся клетки.

5.                
Сделать выводы о молодых
клетках

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 16

Живые клетки
чешуи лука

Цель работы: Изучить и
рассмотреть живые клетки чешуи лука

Материалы и оборудование: микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, пипетка, пинцет

Ход работы:

1.                
Приготовить временный препарат
чешуи лука.

2.                
Рассмотреть препарат в воде
под покровным стеклом при малом и большом увеличении.

3.                
Зарисовать клетки эпидермиса
внутренней чешуи луковицы лука: общий вид и плазмализированные клетки.

4.                
Сделать подписи к рисунку.
Описать препарат.

5.                
Сделать выводы

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА№ 17

Строение
зрелого листа элодеи

Цель работы:

Изучить внешнее и внутреннее строение зрелого листа элодеи

Материалы и оборудование: предметные стекла, покровные стекла, микротом, пипетка,
микроскоп, препаровальные иглы.

Ход работы:

1.                
Ознакомиться с общим планом
строения листа, более детально рассмотреть особенности слагающих его клеток при
большом увеличении.

2.                
Приготовить временный препарат
сформированного листа элодеи.

3.                
Оторванный от стебля лист
положить нижней стороной в каплю воды на предметное стекло, накрыть покровным
стеклом и рассмотреть при малом и большом увеличении микроскопа.

4.                
Лист элодеи значительно больше
поля зрения микроскопа, поэтому даже при работе с малым увеличением препарат
приходится передвигать.

5.                
Зарисовать и описать препарат.
Сделать подписи к рисункам.

6.                
Сделать выводы о строении
листа элодеи

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 18

Биологические
мембраны. Плазмолиз

Цель работы:

Изучить биологические мембраны

Материалы и оборудование: пробирки, пипетка, покровные и предметные стекла, микроскоп,
микротом, спирт, глицерин, раствор сахарозы, уксус, свекла

Ход работы:

1.                
Рассмотреть рисунок
биологической мембраны.

2.                
Зарисовать схему строения.

3.                
Проведите исследование
характеристик плазмолиза растительных клеток в растворах различных веществ. На
два предметных стела нанести по капле раствора: на одно – 1 М раствор сахарозы,
на другое 1 М раствор глицерина.

4.                
В каждую каплю поместить по
фрагменту окрашенного эпидермиса лука, накрыть покровными стеклами и рассмотреть
под микроскопом.

5.                
Найти участки с плазмолизированными
клетками. Отметить время начала плазмолиза.

6.                
Рассмотреть препараты через
10–30 мин. В растворе сахарозы наблюдается стойкий плазмолиз, а в растворе
глицерина временный. Причиной деплазмолиза в растворе с глицерином является
проницаемость плазмалеммы для молекул глицерина.

7.                
На основе анализа результатов
экспериментов выявить различия в продолжительности сохранения плазмолизированого
состояния, вызванном различными осмолитиками, и сделать вывод об относительной
проницаемости плазмалеммы для исследуемых веществ.

8.                
Определить влияние
температуры, а также кислот и спиртов на проницаемость клеточных мембран для
бетацианина по его выходу в наружный раствор.

9.                
Корнеплоды свеклы разрезать на
брусочки, длинной 2-3 см.

10.           
Тщательно промыть их под
водопроводной водой. Вырезать из свеклы кусочки размером 1х2 см, промыть их.

11.           
Опустить кусочки в пробирки с
разными растворами: а) водопроводной водой (контроль); б) с кипящей
водопроводной водой; в) с 30% уксусной кислотой. г) со спиртом

12.           
Опыт объяснить и записать
результаты. Из проведенных опытов сделать вывод о свойствах проницаемости
мембран.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 19

Строение
лейкопластов

Цель работы: Изучить
строение лейкопластов

Материалы и оборудование: микроскоп, микротом, пипетки, покровные и предметные стекла,
листья традесканции, раствор сахарозы

Ход работы:

1.                
Приготовить временный препарат
листа традесканции и рассмотреть клетки имеющие лейкопласты.

2.                
С верхней или нижней стороны
линейного листа традесканции снять эпидермис.

3.                
Положить эпидермис на
предметное стекло в каплю 2М раствор сахарозы.

4.                
Накрыть покровным стеклом и
рассмотреть при малом и большом увеличении микроскопа.

5.                
Зарисовать и описать препарат.
Сделать подписи к рисункам.

6.                
Сделать вывод о микроскопическом
строение двумембранных органелл.

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 20

Крахмальные
зерна

Цель работы: Изучение
крахмальных зерен картофеля

Материалы и оборудование: микротом, микроскоп, картофель, предметные покровные стекла,
пипетка, чашка Петри, йод

Ход работы:

1.                
Рассмотреть и зарисовать зерна
крахмала в клетках клубня картофеля.

2.                
Отрезать маленький кусочек
клубня картофеля и сделать им мазок на предметном стекле в капле воды.

3.                
При этом из разрушенных клеток
в воду переходят крахмальные зерна, в результате чего она мутнеет. Каплю
накрыть покровным стеклом и рассмотреть при малом и большом увеличении.

4.                
При большом увеличении хорошо
видны овальные и яйцевидные зерна крахмала с эксцентрической слоистостью.

5.                
При рассмотрении слоистости
следует прикрыть диафрагму конденсора и слегка вращать микрометренный винт.
Найти и зарисовать простые, сложные и полусложные крахмальные зерна.

6.                
Провести качественную реакцию
на крахмал с помощью йода, положив кусочек картофеля на чашку Петри и капнуть
йод. Отметить изменения

7.                
Сделать выводы

ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 21

Методы
обнаружения белков

Цель работы:

Ознакомиться с методами обнаружения белков и их физико-химическими
свойствами.

Материалы и оборудование: зародыши гороха и пшеницы, 7% раствор CuSO4 покровные и
предметные стекла, фильтровальная бумага, 30% раствор NаОН или КОН, Дистиллированная
вода, 0,5—1% водный раствор нингидрина, 5% раствор три- хлоруксусной кислоты, 1%-ного
раствора яичного белка, 96% этилового спита или ацетона, концентрированная серная
или соляная кислота, сульфосалициловая кислота, трихлоруксусная кислота, 5% раствор
хлорного железа, 5% раствор уксуснокислого свинца, 7%раствор сернокислой меди.

Ход работы:

1.                
Провести биуретовую реакцию
для выявления в молекулах белков пептидных связей. Объекты помещают на 5–15 мин
в 7%-ный медный купорос в часовом стекле.

2.                
Отсасывают раствор
фильтровальной бумагой. Объекты промывают в воде и переносят их на предметное
стекло в каплю 30%-ного раствора NаОН или КОН на 10–40 мин до появления
окраски.

3.                
Провести нингидриновую реакцию
на аминогруппы. Реакцию проводят в двух вариантах: с предобработкой материала и
без предобработки трихлоруксусной кислотой в течение 10–15 мин. и последующей
промывкой водой.

4.                
Подогревают до появления синей
окраски. Окраска свидетельствует о присутствии аминогрупп. Сохранение окраски
объекта после обработки кислотой указывает на выявление аминогрупп белка.

5.                
Окрашенное соединение (синее,
фиолетовое) возникает после присоединения азота аминокислоты к нингидрину.
Реакция без предобработки выявляет все аминогруппы как белка, так и свободных
аминокислот.

6.                
Осаждение белка при
нагревании.

7.                
В пробирку налить 0,5мл 1%-ного
раствора яичного белка.

8.                
Содержимое пробирки нагреть
над пламенем спиртовки и наблюдают появление опалесценции (помутнение раствора).
Объяснить, с чем связано осаждение белка.

9.                
Осаждение белков: Осаждение белка
органическими растворителями: К 5 каплям 1%-ного раствора яичного белка
добавить 20–25 капель 96%-ного этилового спирта или ацетона и 1 каплю
насыщенного раствора хлористого натрия.

10.           
Осаждение белка
концентрированными минеральными кислотами: В пробирку накапать 10–15 капель
концентрированной азотной кислоты и, наклонив ее под углом 45°, осторожно, по
стенке пробирки добавить из пипетки равный объем 1%-ного раствора какого-либо
белка.

11.           
То же можно проделать, взяв
вместо азотной кислоты концентрированную серную или соляную кислоты.

12.           
Осаждение белка некоторыми
органическими кислотами: К 0,5мл раствора яичного белка добавить 1–2 капли
10%-ного раствора сульфосалициловой кислоты. То же проделать с 10%-ным раствором
трихлоруксусной кислоты.

13.           
Осаждение белка солями тяжелых
металлов. В три пробирки налить по 0,5 мл 1%-ного раствора яичного белка и
добавить в первую 1 каплю 5%-ного раствора хлорного железа, во вторую – 1 каплю
5%-ного раствора уксуснокислого свинца, в третью – 1 каплю 7%-ного раствора
сернокислой меди.

14.           
К такой же порции белка
прибавить вначале 1 каплю раствора соли тяжелого металла, а затем еще 5–6
капель. Пронаблюдать ход реакций и объяснить.

15.           
На основании проведенных
опытов сделать выводы о физико–химических свойствах белков.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
№ 22

Методы
обнаружения углеводов

Цель работы:

Обнаружить запасные сахара в различных растительных объектах и
определить их принадлежность к определенной группе углеводов.

Материалы и оборудование: Морковь, картофель, 1 М раствор сахарозы, 20% HCl, раствор
Фелинга, 30-50% раствор альдозы 46 или глюкозы, микротом, чашка Петри,
электроплитка, Фильтровальная бумага, Пробирки и воронка, Стеклянная палочка,
Спиртовка с держателем, Раствор йодида калия, Раствор L-нафтола в 96%-ном
этиловом спирте, Серная кислота, пробирки

Ход работы:

1.                
Реакции на сахара обычно
проводят на свежем материале. Провести йодную реакцию на крахмал. Срезы
картофеля не должны быть тонкими, чтобы можно было выбрать неповрежденные слои
клеток для исследования. Для наблюдения реакции используют раствор йода в
йодиде калия. На объект, находящийся на предметном стекле, наносят каплю
реактива и накрывают покровным стеклом. Реактив действует моментально,
окрашивая крахмал в сине- фиолетовый цвет.

2.                
Провести реакцию с L-нафтолом
на простые и сложные углеводы. Объект помещают на предметное стекло в раствор
L-нафтола в 96%-ном этиловом спирте, добавляют две капли серной кислоты и накрывают
покровным стеклом. При наличии глюкозы быстро появляется фиолетовая окраска.
Если реакция наблюдается через 30–45 мин, то это свидетельствует о том, что под
действием кислоты другие углеводы превратились в глюкозу. Данная реакция не
является специфичной.

3.                
Качественные реакции с
раствором Фелинга. Провести контрольную реакцию раствора Фелинга с раствором
альдозы (глюкозы, галактозы): 30-50% раствор альдозы (1-2 мл) смешать с таким
же объемом раствора Фелинга и нагреть до кипения.

4.                
Провести такую же реакцию с
сахарозой. Раствор сахарозы смешать с 2-3 каплями 20% соляной кислоты,
прокипятить в течение 1 минуты, добавить равный объем раствора Фелинга и
прокипятить.

5.                
Результаты записать в тетради
и объяснить.

6.                
Нарезать мелко растительный материал,
( морковь и т.д.), добавить немного воды и нагревать на водяной бане в течение
5 минут. Профильтровать.

7.                
Половину фильтрата смешать с
раствором Фелинга и нагреть до кипения.

8.                
Вторую половину фильтрата
смешать с 2-3 каплями 20% соляной кислоты, затем, после гидролиза сахарозы,
провести реакцию Фелинга.

9.                
Сделать выводы из проведенных
опытов.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ
КРАСИТЕЛЕЙ

Фуксин
основной спиртовой раствор – насыщенный

Фуксин основной кристаллический – 10
г

Этиловый спирт, 96%                         — 100 мл

Фуксин
растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Раствор может храниться долгое время в
бутылке из темного стекла с притертой пробкой.

Фуксин основной
карболовый – фуксин Циля

Фуксин основной кристаллический – 1
г

Карболовая кислота
(фенол)             — 5 г

Этиловый спирт, 96°                
         — 10 мл

Дистиллированная
вода                     — 100 мл

При
приготовлении раствора предварительно взвешивают определенное количество (1
г) фуксина основного кристаллического, вносят в фарфоровую ступку и растирают
с определенным количеством (5 г) карболовой кислоты, добавляя спирт небольшими
порциями  и дистиллированную воду до полного растворения кристаллов, после чего
приливают оставшуюся воду. Приготовленный краситель ставят в термостат при 37 °С на двое суток.
Затем отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр.

Фуксин основной
карболовый устойчив и может храниться долго. Хранить следует в бутылке из темного
стекла с притертой пробкой.

Фуксин основной
карболовый можно приготовить другим способом:

Вначале готовят
два раствора.

1-й
раствор

Фуксин основной
кристаллический – 1 г

Этиловый спирт, 96°                         
— 10 мл

Смесь растирают в
фарфоровой ступке до полного растворения кристаллов фуксина.

2-й
раствор

Карболовая
кислота        – 5 г

Дистиллированная
вода  – 95 мл                                

Воду подогревают
до 50 °С для лучшего растворения карболовой
кислоты. Второй раствор вливают в первый, хорошо взбалтывают и фильтруют через
складчатый бумажный фильтр.

Фуксин основной,
водный (фуксин Пфейффера)

Карболовый фуксин Циля – 10 мл

Дистиллированная
вода     — 90 мл

Водный
фуксин нестоек, его лучше готовить непосредственно перед употреблением. Раствор
водного фуксина может храниться не более 10 дней.

Карболовый генциановый фиолетовый

Генциановый фиолетовый (кристаллы)
– 1 г

Этиловый
спирт,96%                                 — 10 мл

Карболовая
кислота                                  — 5
г

Дистиллированная
вода                           — 100 мл

Техника
приготовления карболового генцианового фиолетового такая же, как карболового
фуксина Циля.

При приготовлении
карболового генцианового фиолетового можно также готовить предварительно два
раствора.

1-й раствор

Генциановый
фиолетовый – 1 г

Этиловый спирт,
96%          — 10 мл

2-й
раствор

Карболовая
кислота       – 5 г

Дистиллированная
вода – 95 мл

Последовательность
и способ приготовления первого и второго растворов такие же, как и при
приготовлении карболового фуксина Циля.

Приготовление
красящих бумажек генцианвиолета (по Синеву)

Для приготовления
бумажек фильтровальную бумагу предварительно испытывают на пригодность. Для
этого полоску фильтровальной бумаги погружают в спиртовой раствор красителя
(карболового генцианового фиолетового), высушивают на воздухе. Хорошая бумага
окрашивается равномерно без пятен. Если небольшой кусок такой бумаги положить
на стекло с несколькими каплями воды, он сразу же пропитается водой и краситель
через несколько секунд перейдет в раствор. Бумагу для пропитывания нарезают
полосками (шириной 2,5-3 см, длиной 30
см) и погружают в краситель так, чтобы смачивались обе поверхности. Затем
полоски вынимают, высушивают на воздухе при комнатной температуре или в
термостате при 37° С.

Пропитывать
красящиеся бумажки можно также спиртовым раствором генцианвиолета следующего
состава:

Генциановый
фиолетовый (кристаллы) – 1 г

Спирт этиловый, 96°                               
— 100 мл

Глицерин                         
                         — 5 мл

Метиленовый
синий (насыщенный спиртовой раствор)

3
г
метиленового синего растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Раствор выдерживают
2-3 дня, периодически взбалтывая. Затем фильтруют через бумажный фильтр.
Раствор устойчив.

Раствор
бриллиантовой зелени (раствор малахитового зеленого)

Водный
насыщенный раствор готовится путем растворения 10
г малахитового зеленого в 10 мл дистиллированной воды. Спиртово-водный
раствор: 10 г малахитового зеленого смешивается с 80 мл дистиллированной
воды и 20 мл 96%-ного этанола.

Метиленовый
синий 1:40

1 мл насыщенного
спиртового раствора метиленового синего смешивают с 40 мл дистиллированной
воды.

Метиленовый
синий, щелочной раствор  (по Леффлеру)

К 100 мл
дистиллированной воды прибавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора
мителенового синего и 1 мл 1%-ного водного раствора гидроксида калия.

Метиленовый
синий по Финку

Отдельно
взвешивают 0,9 г гидрофосфата натрия, 13,6 дигидрофосфата калия и 0,1
г метиленового синего. Каждую навеску растворяют в 500 мл дистиллированной
воды. Смешивают 0,25 мл первого раствора с 99,75 мл второго  и 100 мл третьего
(рН 4,6).

Сафранин
(водный)

10
мл 2,5%-ного раствора сафранина в 96%-ном этаноле смешивается со 100 мл
дистиллированной воды.

Раствор
Люголя (в модификации Грама)

В ступку
вместимостью 30-50 мл помещают 1 г кристаллического йода и 2
г йодида калия,  растирают смесь пестиком, добавляют 1 мл дистиллированной
воды, продолжают растирать кристаллы и добавляют еще 5 мл воды. При этом йод
растворяется в йодиде калия. Раствор количественно переносят в склянку и
доводят общий объем до 300 мл. Раствор годен не более 30 дней, хранят его в
прохладном месте, в темноте, лучше в посуде оранжевого цвета.

Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы

Кристаллический
йод     – 1 г

Йодид
калия                     — 3 г

Вода
дистиллированная – 300 мл

Раствор
готовят так же, как и предыдущий.

Для
обнаружения гликогена можно также использовать крепкий раствор йода

Кристаллический
йод     – 7 г

Йодид
калия                     — 20 г

Вода
дистиллированная – 100 мл

Краска Муромцева

Готовят
два раствора:

1-й
раствор

Фуксин
основной                                  – 0,15
г

Спирт,
96%                                              — 20 мл

Кристаллическая
карболовая кислота – 10 г

2-й
раствор

Метиленовый
синий      – 2,5 г

Дистиллированная
вода – 200 мл

Оба
раствора смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Раствор туши для выявления капсул

Смешивают
10 мл жидкой натуральной туши  с 90 мл дистиллированной воды. Затем раствор
центрифугируют 15-20 мин. Верхний слой переносят в пробирку и автоклавируют 30
мин (0,05 МПа, температура 110 ⁰С). После автоклавирования раствор
отстаивают две недели, после чего его можно использовать.

Список
используемой литературы

1.      Вербина Н.М., Каптерева Ю.В. Микробиология
пищевых производств: Учебник. – М.: Агропромиздат, 1988. – 256 с.

2.      ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые.
Порядок отбора проб для микробиологических анализов».

3.      ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты.
Методы микробиологического анализа».

4.      ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Метод
определения дрожжей и плесневых грибов».

5.      ГОСТ 25102-90 «Молоко и молочные продукты.
Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий».

6.      Королева Н.С. Основы микробиологии и гигиены
молока и молочных продуктов. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. – 168
с.

7.      Лерина И.В., Педенко А.И. Лабораторные работы
по микробиологии: Учеб. Пособие для товаровед. и технол. фак. торг. вузов. – 2
изд., перераб. – М.: Экономика, 1986. – 128 с.

8.      Медико-биологические требования и санитарные
нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. – М.: Изд-во
стандартов, 1996.

9.      Методы микробиологического контроля продуктов
детского, лечебного питания и их компонентов: Методические указания МУК
4.2.577-96. – М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. –94
с.

10. Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой
воды: Методические указания МУК 4.2.671-97. – М.: Информационно-издательский
центр Минздрава России, 1997. –36 с.

11. Микробиологические основы молочного производства:
Справочник / Л.А. Банникова, Н.С. Королева, В.Ф. Семенихина; Под ред. канд.
техн. наук Я.И. Костина. – М.: Агропромиздат, 1987. – 400 с.

Департамент образования города Москвы

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования города Москвы

Технологический колледж №28

Жукова Л.А.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

 для учащихся профессии НПО

 34.17 Оператор процессов колбасного производства.

Москва

 2012

«Основы микробиологии, санитарии и гигиены»

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

для учащихся профессии НПО

34.17 Оператор процессов колбасного производства.

_______________________________________________________________

Помимо приобретения теоретических знаний по микробиологии будущим специалистам необходимы лабораторно-практические занятия, являющиеся по сути небольшими научно-исследовательскими работами.

Выполнение лабораторных работ обеспечивает закрепление теоретических знаний студентов, развитие навыков по микробиологическому контролю и способностей к самостоятельным выводам и обобщениям.

Пособие предназначено студентам колледжа. Может быть использовано для самостоятельной подготовки к учебным занятиям и внеаудиторной самостоятельной работе.

Составитель: Жукова Л.А. – преподаватель специальных дисциплин

Рецензент: Суханова Н.В.– преподаватель специальных дисциплин

Редактор: Малькова Л.А. – заместитель директора по учебно-методической работе

     Рукопись рассмотрена и обсуждена на заседании ЦМК Технологических дисциплин, протокол № __ от  __  _______  2012г.

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Методические указания разработаны в соответствии с действующей программой курса микробиологии, принятой ГАОУ СПО города Москвы Технологическим колледжем №28 для студентов, обучающихся по специальности 260301  «Технология мяса и мясных продуктов».

На современном уровне развития естественных наук требуются глубокие знания микробиологических процессов, лежащих в основе многих биотехнологических производств и служащих гарантией защиты окружающей среды от антропогенного воздействия.

Помимо приобретения теоретических знаний по микробиологии будущим специалистам необходимы лабораторно-практические занятия, являющиеся по сути небольшими научно-исследовательскими работами.

Выполнение лабораторных работ обеспечивает закрепление теоретических знаний студентов, развитие навыков по микробиологическому контролю и способностей к самостоятельным выводам и обобщениям.

Данные методические указания по выполнению лабораторных работ предлагают:

объединить лабораторные работы по одной теме или имеющие одно смысловое содержание так, чтобы удобно было их организовать во времени, как это требует специфика микробиологических анализов;

распределить занятия так, чтобы загруженность последнего занятия давала возможность обсудить результаты анализа, провести зачет по выполненной работе;

сконцентрировать наиболее важный учебный материал, позволяющий студентам без излишней загруженности освоить практические навыки работы в микробиологической лаборатории;

дать методику проведения анализа с указанием сущности метода, техники выполнения, правил обработки результатов;

использовать те методы микробиологического анализа, которые предусмотрены ГОСТом.

Содержание лабораторных работ спланировано следующим образом:

Тема и цель работы.

Материальное обеспечение лабораторной работы.

Рекомендации по выполнению лабораторной работы, задание, пояснение к работе, методика проведения анализов, формы для составления отчета, контрольные вопросы к лабораторным вопросам и дополнительная литература.

Ввиду сложности некоторых методов и длительности выращивания микроорганизмов в отдельных случаях часть лабораторного материала готовит заранее преподаватель, но методика приготовления его приводится.

Навыки, приобретенные на лабораторных занятиях, необходимы для проведения микробиологического контроля производства, цель которого заключается в том, чтобы своевременно выявить  нарушение санитарного состояния производства и оборудования, обнаружить места и пути микробного загрязнения, принять необходимые меры по ликвидации этих опасных очагов и добиться выпуска продукции высокого качества.

ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Работа в микробиологической лаборатории требует строгого соблюдения специальных правил, что определяется двумя основными положениями.

Первое – в микробиологической практике используют, главным образом, чистые культуры микроорганизмов, т. е. популяции микроорганизмов одного вида, часто являющихся потомством одной клетки.

Поскольку в воздухе, на поверхности окружающих нас предметов, на одежде, руках, волосах всегда имеется большое количество разнообразной микрофлоры, то для обеспечения стерильности исследований и во избежание загрязнения культур работа должна проводиться с соблюдением правил асептики.

Второе – при исследованиях с неидентифицированными микроорганизмами, при их выявлении из объектов окружающей среды и техногенных потоков, могут быть выделены патогенные и условно патогенные микроорганизмы.

Кроме того, клетки как сапрофитных, так и патогенных микроорганизмов могут являться аллергенами для определенных индивидуумов. Таким образом, для получения достоверных результатов исследований, для обеспечения личной безопасности и безопасности окружающих необходимо соблюдение определенных правил.

При пересевах микроорганизмов стерильность достигается за счет того, что вся работа проводится вблизи пламени горелки. Бактериологические петли, используемые для пересева микроорганизмов с твердых сред, прокаливают в пламени горелки, а стеклянную посуду и питательные среды предварительно стерилизуют в сушильных шкафах и в автоклавах соответственно.

Поверхность рабочего стола дезинфицируют как перед работой, так и после её окончания, протирая 3%-ным раствором хлорамина, лизола или 70%-ным раствором изопропилового или этилового спирта. Растворы данных спиртов могут применяться и для дезинфекции рук.

Подготовка помещения  включает мокрую уборку и тщательную вентиляцию с последующим облучением ультрафиолетовым светом бактерицидных ламп. В зависимости от степени загрязненности воздуха для его стерилизации требуется облучение от 30 минут до нескольких часов. Ультрафиолетовые лучи опасны для глаз, поэтому при включенной бактерицидной лампе в помещении находиться нельзя.

При работе в микробиологической лаборатории учащиеся должны соблюдать следующие правила:

1. Каждый студент должен работать на постоянном месте.
2. На рабочем месте не должно быть посторонних предметов (в том числе портфелей и сумок). Во время работы с горелкой на столе не должно быть также и тетрадей, которые понадобятся позже при микроскопии и зарисовке препаратов.
3. Вся работа выполняется в чистом халате. Длинные волосы должны быть подобраны, во избежание их попадания в пламя грелки.
4. На посуде, применяющейся для культивирования микроорганизмов (пробирках, колбах, чашках Петри, матрацах), должны быть сделаны надписи, содержащие родовое и видовое название культуры, дату засева, фамилию студента и номер группы.
5. Все предметы, использованные при работе с живыми культурами, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки, либо погружены в дезинфицирующий раствор (предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели).
6. Все засеянные пробирки, чашки или колбы помещаются в термостат или сдаются лаборанту.
7. Отработанный материал помещается в определенные емкости для их дальнейшего обеззараживания.
8. В лаборатории строго запрещается курение и прием пищи.
9. В конце занятий каждый студент должен привести в порядок рабочее место.

Полученные данные должны быть зафиксированы в журнале для лабораторных работ. Записи должны содержать: номер и название работы, дата её начала и окончания, названия объектов исследований, условия проведения опытов, методы анализов, а также полученные результаты и выводы из них. При изучении морфологии культур делаются их зарисовки при определенных увеличениях микроскопа. (На занятиях следует иметь цветные карандаши, как минимум красный и синий.) Цифровые данные обобщаются в таблицах, графиках или диаграммах.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1

Организация и оборудование микробиологической лаборатории. Устройство оптического микроскопа и правила работы с ним. Освоение техники микроскопирования микробов.

Цель занятия.

Ознакомить студентов с организацией и оборудованием микробиологической лаборатории. Изучить устройство оптического микроскопа. Ознакомиться с основными формами бактерий.

Материальное обеспечение.

Учебная микробиологическая лаборатория, оснащенная термостатами, стерилизаторами, холодильниками, водяной баней, дистиллятором, бактерицидными лампами, рабочими столами со всеми необходимыми принадлежностями, микроскопами.

Рекомендации по выполнению работы.

Данная лабораторная работа содержит значительный объем учебного материала, поэтому ознакомить студентов с организацией и оборудованием лаборатории желательно демонстрационным методом.

При изучении устройства микроскопа использовать плакат, где показаны все его детали.

Задания.

1. Ознакомиться с пояснением к работе:

1. Оборудование учебной микробиологической лаборатории.
2. Оснащение и организация работы производственной

      микробиологической (бактериологической) лаборатории.

1. Правила работы в микробиологической лаборатории.
2. Устройство оптического микроскопа и уход за ним.

   Правила работы с микроскопом МБР-1.

1. Основные формы бактерий.

1. Провести микроскопию готовых препаратов с основными формами  

      бактерий.

1.  Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.
2. Ответить на контрольные вопросы.  

Пояснение к работе

1.1 Оборудование учебной микробиологической лаборатории.

Помещение учебной микробиологической лаборатории должно состоять из учебной,  технической комнат и комнаты преподавателя.

В учебной комнате должен быть следующий инвентарь: лабораторные столы, столы для микроскопирования, стол для преподавателя, термостаты, табуреты, полка с титрованными растворами, весы, классная доска, стол для посуды, раковина.

Для учебных занятий может быть использован обычный лабораторный стол.

Стол для микроскопирования необходимо устанавливать перед окном; его высота должна быть около 80 см, ширина – около 40 см. Для большей устойчивости стол для микроскопирования устраивают на кронштейнах.

Термостаты. Микробы необходимо выращивать при таких условиях, чтобы температура окружающего воздуха подвергалась, возможно, меньшим колебаниям. Для этого применяют термостаты, представляющие собой шкафы, в которых поддерживается постоянная температура.

Существуют воздушные и водяные термостаты.

Воздушные термостаты обогреваются теплым воздухом, нагреваемым, как правило, электрическим током.

В водяных термостатах между двойными стенками находится вода, нагреваемая электрическим током, газом или другими источниками тепла. Колебания температуры в этих термостатах меньше, чем в воздушных.

В лаборатории должно быть не меньше трех термостатов: температура одного 30˚С, второго 37˚С и третьего 43˚С. Микробов, хорошо развивающихся при 20˚С, можно выращивать при комнатной температуре.

Постоянная температура в термостатах поддерживается специальными приспособлениями – терморегуляторами. В термостате с точным терморегулятором колебания температуры не должны превышать  2˚С.

Автоклав, или стерилизатор. Автоклав представляет собой металлический цилиндр с двойными стенками и массивной крышкой, которая закрывается винтовыми зажимами.

На цилиндр надевается металлический кожух. Автоклав снабжен пароотводной трубкой, манометром, предохранительным клапаном и водомерным стеклом. В нем стерилизуют питательные среды, различные жидкости и посуду.

Перед стерилизацией в автоклав через воронку водомерного стекла наливают дистиллированную или кипяченую воду (при употреблении сырой воды быстро образуется накипь) до черты, указанной на кожухе автоклава. После этого автоклав загружают подлежащим стерилизации материалом (последний необходимо сверху закрывать бумагой), крепко завинчивают  крышку, открывают кран пароотводной трубки и начинают подогревать.

Нагрев осуществляется электричеством, паром (в этом случае воду в автоклав не наливают) или несколькими газовыми горелками. По мере нагревания из автоклава начинает выходить сначала воздух, а затем пар, который поступает в автоклав через отверстия в верхней части цилиндра. Когда пар начнет выходить непрерывной струей, его выпускают еще 2-3 минуты для вытеснения воздуха из автоклава, а затем кран закрывают. Вследствие этого прекращается выход пара и постепенно в автоклаве начинает повышаться давление (подъем стрелки манометра).

После установления требуемого давления степень нагревания автоклава уменьшают так, чтобы стрелка манометра оставалась на одном уровне в течение определенного времени. Начало стерилизации считается с момента достижения стрелкой надлежащего давления.

Показания манометра соответствуют определенной температуре пара.

Показания манометра в ати                            Температура пара в ˚С

                0,5                                                                  112,0

                1,0                                                                  121,4

                1,5                                                                  128,8

                2,0                                                                  135,1  

По окончании стерилизации нагревание прекращают и дают стрелке манометра упасть до нуля. Только после этого открывают кран пароотводной трубки, выпускают пар и впускают воздух, затем отвинчивают крышку, поднимают её и, дав в таком положении остыть автоклаву, вынимают простерилизованный материал.

Посуда и инвентарь.

Чашки Петри служат для посева культур. Употребляют чашки диаметром 10 см (высота 1,5см). Стекло должно быть тонким, прозрачным, без пузырьков воздуха.

Пипетки. При бактериологической работе используют пипетки емкостью 1 -5 и 10 мл. Чаще всего применяются пипетки емкостью 1 мл, длиной около 28 см (без расширения).

Пробирки. Для разливания воды по 10 мл применяются пробирки размером 18 х 2,0 см; используют также пробирки размером 18 х 1,5 см. Для питательных сред используют пробирки размером 15 х 1,8 см.

Иглы и петли. Для взятия исследуемого материала и для посевов пользуются иглами и петлями.

Для мытья лабораторной посуды необходим стол с ванной для мойки.

При работе с микроскопом используют предметные и покровные стекла. Стекла должны быть бесцветными с ровной поверхностью, без пузырьков воздуха. Для специальных исследований применяют предметные стекла с лунками.

1.2 Оснащение и организация работы производственной

     микробиологической (бактериологической) лаборатории.

Бактериологическое исследование продовольственного сырья и продуктов из него проводят в специальной лаборатории, имеющей разрешение на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности. Микробиологическая (бактериологическая) лаборатория (или бакотдел в составе производственной лаборатории мясоперерабатывающего предприятия) предназначена для санитарно-бактериологического контроля сырья, готовой продукции, вспомогательных материалов, санитарно-гигиенического состояния технологического оборудования, инвентаря, тары, одежды и рук персонала.

Помещения лаборатории. Общее размещение лаборатории и её инфраструктура должны соответствовать требованиям ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). В лаборатории предусматриваются следующие отдельные помещения или изолированные рабочие зоны:

для приема, хранения, подготовки и обработки проб;

для проведения первичного посева, пересева, приготовления разведений и других работ в асептических условиях;

для приготовления, стерилизации, розлива и хранения питательных сред, подготовки лабораторной посуды и оборудования;

для обеззараживания и очистки оборудования, отработанных питательных сред и контаминированных микрофлорой материалов.

Термостаты, холодильники, морозильники могут быть расположены в отдельных комнатах.

Помещения необходимо располагать так, чтобы обеспечить защиту их от влияния внешних факторов (повышенная температура, влажность, запыленность, шум, вибрация), организовать поточность прохождения чистых и зараженных материалов.

Мясо может быть обсеменено патогенной микрофлорой, представляющей серьезную опасность для здоровья людей, и помещения лаборатории должны быть изолированы от других отделов. Если нет возможности организовать отдельную комнату, допускается в общем помещении установить стол для проведения первичного посева проб. Целесообразно оборудовать застекленный бокс с предбоксником для обеспечения асептических условий работы.

Лабораторные комнаты должны быть светлыми (освещенность поверхности столов в пределах 500 лк) и просторными – для каждого аналитика  рекомендуемая площадь рабочего места около 20 м. Стены, потолок и пол должны быть гладкими, легкоочищаемыми, устойчивыми к действию детергентов и дезинфицирующих веществ. Для удобства очистки и дезинфекции поверхность лабораторного инвентаря и мебели покрывают гладким непроницаемым материалом, например пластиком, а рабочее место — зеркальным столом.

Для бактериологического анализа пищевых продуктов, в частности колбасных изделий и копченостей, необходимы 1-2 бокса с предбоксниками. Боксы представляют собой изолированные, защищенные от пыли остекленные комнаты; максимально допустимое количество частиц размером более 0,5 мкм в 1м не должно превышать 4000.

В помещениях лаборатории регулярно проводят уборку и дезинфекцию, качество которых периодически контролируют микробиологическим методом.

В каждом помещении должны быть холодное и горячее водоснабжение, бутыль с дезинфицирующим раствором для мытья рук.

1.3 Правила работы в микробиологической

лаборатории

Непосредственный контакт с микроорганизмами и необходимость соблюдения стерильных условий при проведении всех операций требуют знания и неукоснительного соблюдения следующих правил:

работать в халатах;

поддерживать чистоту и порядок на рабочем месте;

не касаться пальцами микробных налетов и конденсационной воды в пробирках и чашках с посевами;

не стирать микробных налетов с предметных и покровных стекол и других объектов салфетками, фильтровальной бумагой, дезинфицировать их, помещая в спирт или раствор карболовой кислоты;

в процессе работы и после проведения посевов уничтожать остатки микробных налетов на бактериологических иглах и петлях прокаливанием в пламени спиртовки или газовой горелки;

обезвреживать использованные загрязненные материалы и отработанные культуры микробов стерилизацией в автоклаве (эту работу выполняют сотрудники лаборатории);

не держать спиртовки близко к лицу, зажигать спиртовку только спичкой;

убрать и обработать рабочее место по окончании работы дезинфицирующим раствором под контролем лаборанта; поместить культуры микроорганизмов, необходимые для дальнейшей работы, в холодильник или сейф, который закрывают и пломбируют; поставить в термостат засеянные микрофлорой пробирки и чашки Петри;

мыть тщательно руки по окончании работы, не принимать пищу в лаборатории.

1.4 Устройство оптического микроскопа и уход за ним.

Микроскоп – сложный оптический прибор, увеличивающий предмет в 1000 – 1500 раз. Современный микроскоп состоит из двух основных частей – механической и оптической.

Механическая часть состоит из штатива, в котором различают ножку, основание, тубусодержатель, и предметного столика, прикрепляемого к основанию штатива. Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного и наблюдательного аппаратов.

Осветительный аппарат расположен под предметным столиком и состоит из зеркала, конденсора и ирис-диафрагмы.

Зеркало отражает световые лучи и направляет их к конденсору.

Конденсор представляет собой систему линз и служит для усиления яркости освещения рассматриваемого объекта.

К наблюдательному аппарату относят объективы и окуляры.

Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя или фронтальная линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе – коррекционные.

Биологические микроскопы МБР-1 и МБИ-1 обычно имеют три, четыре объектива с цифровыми обозначениями х8, х20, х40, х90, показывающими собственно увеличение этих объектов.

Окуляр вставляется в верхний конец тубуса. Окуляр представляет собой систему двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклостью в сторону объектива. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, обращенная к препарату – собирающей. Окуляры отечественных микроскопов помечаются цифрами, показывающими их собственное увеличение: х5, х7, х10, х15.

Степень увеличения микроскопа равна произведению степени увеличения окуляра на степень увеличения объектива.

Правила ухода за микроскопом:

Микроскоп предохраняют от попадания пыли, влаги и солнечных лучей. После работы с ним его помещают в футляр или накрывают колпаком из плотной ткани.

Объективы и окуляры протирают замшей или фланелью.

Тубус микроскопа не оставляют открытым, т. е. без окуляра, так как это приводит к накапливанию пыли в тубусе и загрязнению объективов.

Микроскоп состоит из двух основных частей. Основой микроскопа является штатив. К нему прикреплен тубус с заключенной в нем оптической частью и предметный столик. Штатив  состоит из основания (или подковообразной ножки) и тубусодержателя. Тубусодержатель соединяется с основанием шарниром, что позволяет верхнюю часть микроскопа устанавливать в наклонное положение для облегчения работы. В тубус помещают объективы и окуляры. Объективы ввинчиваются в нижнюю часть тубуса, называемую револьвером. Окуляры свободно вкладываются в верхнюю часть тубуса. Увеличение можно изменить путем применения различных объективов, которые ввинчивают во вращающийся барабан револьвера.

Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта. Чтобы препарат был ясно виден, тубус при помощи механизмов грубого или микрометрического движения необходимо передвигать в направлении его оптической оси. Грубое движение должно осуществляться достаточно легко, но без самопроизвольного опускания тубуса. Для более точной установки служит микрометрический винт. Микрометрический винт имеет сложную конструкцию, является одной из наиболее легко повреждающихся частей микроскопа. Нельзя поворачивать винт более чем на пол-оборота в ту или иную сторону (после грубой установки микроскопа). Предметный столик служит для помещения исследуемого препарата.

Оптическая часть состоит из зеркала, конденсора с диафрагмой, объективов и окуляров. Зеркало микроскопа подвижное. При искусственном свете лучше пользоваться вогнутым зеркалом, при рассеянном свете – плоским. Зеркало отражает световые лучи и направляет их к конденсору. Конденсор применяется для получения более сильного освещения препарата. Диафрагма служит для регулирования освещенности препарата. Диафрагма находится между нижней поверхностью конденсора и зеркалом.

Объективы – наиболее важная часть микроскопа, определяющая его оптическую мощность. Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя или фронтальная линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе коррекционные. Окуляры увеличивают изображение, даваемое объективом, но не выявляют каких-либо деталей исследуемого препарата.

Объективы, которые при работе нужно погружать в кедровое масло, называют иммерсионными, или погружными. Сухой объектив – это объектив, у которого между препаратом и линзой находится воздух. Каждый микроскоп снабжен сухими и иммерсионными объективами. Объективы с собственным увеличением 8 и 40 являются сухими, объектив с собственным увеличением 90 – иммерсионный.

Правила работы с микроскопом МБР-1

1. Микроскоп хранят в шкафу для защиты от пыли, влаги и света. Переносят микроскоп правой рукой, держась за ручку штатива, левой поддерживают снизу.
2. Приступая к работе с микроскопом окуляр, объектив и зеркало протрите салфеткой.
3. Установите микроскоп штативом к себе, предметным столиком от себя. По отношению к сидящему микроскоп должен быть сдвинут ближе к левому плечу. Справа от микроскопа располагают альбом, простой и цветные карандаши, ластик.
4. Поставьте в рабочее положение объектив малого увеличения. Для этого поворачивайте револьвер до тех пор, пока нужный объектив не займет срединное положение (встанет над отверстием столика). Когда объектив занимает срединное положение, в револьвере срабатывает специальное устройство – защелка, при этом слышится легкий щелчок и револьвер фиксируется. Запомните, что изучение любого объекта начинается с малого увеличения.
5. Поднимите с помощью макрометрического винта объектив над столиком примерно на 1 см. Откройте диафрагму, поднимите конденсор до уровня предметного столика.
6. Глядя левым глазом в окуляр, при помощи зеркала наведите свет так, чтобы все поле зрения было освещено ярко и равномерно.
7. Положите на предметный столик, приготовленный препарат покровным стеклом вверх, чтобы объект находился в центре отверстия предметного столика. Опустите с помощью макрометрического винта объектив над препаратом на 0,2 см.
8. Смотрите в окуляр, одновременно медленно поворачивайте кремальеру на себя и плавно поднимайте тубус до тех пор (0,5 см), пока в поле зрения не появится изображение объекта; осторожно вращая микрометрический винт не более чем на ½ или ¾ полного оборота, добейтесь четкой видимости.
9. Переходя к рассмотрению объекта при большом увеличении, необходимо центрировать препарат, т.е. поместить интересующую часть объекта в самый центр поле зрения. Для этого передвигайте препарат с помощью препаратоводителей или руками, пока объект не займет нужного положения. Если объект не будет центрирован, то при большом увеличении он останется вне поля зрения.
10. Переходя с меньшего на большее увеличение, поворотом револьвера поставьте объектив большего увеличения против нижнего отверстия тубуса. Смотрите в окуляр и, осторожно вращая микрометрический винт, добейтесь четкого изображения.
11. При зарисовке препарата смотрите в окуляр левым глазом, а правым в альбом.
12. После работы с использованием микроскопа при помощи револьвера замените объектив большого увеличения на объектив малого, снимите со столика препарат и поставьте его на место.
13.  Уберите за собой рабочий стол; препараты и методические указания на стол преподавателя.

1.5 Основные формы бактерий.

По форме бактерии принято делить на шаровидные (кокки), палочковидные (клостридии, бациллы) и извитые (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Кокковидные формы по расположению кокков подразделяются на микрококки – клетки, расположенные одиночно; диплококки – кокки, соединенные по два; тетракокки – кокки, соединенные по четыре; стрептококки – кокки, расположенные в виде длинной или короткой цепочки; сарцины – кокки, расположенные в виде пакетов; стафилококки – беспорядочное скопление кокков, чаще в виде гроздьев винограда.

Палочковидные формы по расположению палочек подразделяют на диплобактерии – палочки, соединенные попарно; стрептобактерии – палочки, расположенные в виде цепочки. Среди спорообразующих различают бациллы и клостридии. У бацилл диаметр спор не превышает ширины вегетативной клетки, а у клостридий – спора больше ширины  клетки, поэтому клетка принимает форму веретена, теннисной ракетки, барабанной палочки.

Извитые формы подразделяют на вибрионы, имеющие формы запятой, спириллы, имеющие несколько (до 5) завитков, и спирохеты с большим количеством мелких завитков.

Порядок выполнения

2. Микроскопия готовых препаратов с основными формами бактерий.

Техника микроскопирования.

Помещают микроскоп на рабочем столе от края на 3-5 см тубусодержателем к себе.

Устанавливают хорошее равномерное освещение поля зрения микроскопа, для чего, глядя в окуляр, зеркалом направляют луч света от источника в объектив. Конденсор должен быть поднят вверх, а диафрагма открыта. Поле зрения микроскопа должно быть хорошо и равномерно освещено во всех точках.

На предметный столик помещают исследуемый препарат и закрепляют клеммами.

При работе с иммерсионным объективом 90 на препарат наносят каплю иммерсионного масла, а затем с помощью макрометрического винта осторожно опускают тубус с центрированным объективом 90 так, чтобы его фронтальная линза погрузилась в каплю масла, а фокус был ниже препарата. Затем, глядя в окуляр, тем же винтом очень медленно поднимают тубус (на сотые доли миллиметра), пока не увидят изображение микробов. Точную установку препарата в фокус объектива производят с помощью микрометрического винта.

Примечание.

Достоинством иммерсионной системы является то, что при погружении объектива в масло, лучи света, проходящие через среды стекло-масло, почти не преломляются, так как показатель преломления света для этих сред почти одинаков. В результате этого освещенность при микроскопировании с маслом максимальна.

По окончании работы удаляют салфеткой из мягкой ткани иммерсионное масло с фронтальной линзы объектива 90, для более полного удаления масла фронтальную линзу протирают салфеткой, смоченной смесью спирта и эфира в пропорции 1:1, затем протирают объектив досуха. Микроскоп помещают на хранение.

При микроскопировании обратить внимание на форму и размер клеток изучаемого микроорганизма, на особенности строения клеток – наличие спор и капсул у бактерий, почек – у дрожжей; в препарате плесеней – на разнообразие форм клеток: круглые, овальные, вытянутые, цилиндрические, ветвистые.

Отчет по результатам микроскопирования.

Результаты микроскопирования заносятся в таблицу (форма1).

                                                                                                       Форма 1

№ п/п	Система микроскопирования	Увеличение микроскопа	Микроскопируемая культура	Рисунок клетки под микроскопом

3. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы.

1. Каким оборудованием должна быть оснащена микробиологическая лаборатория, его назначение?
2. Основные правила работы в микробиологической лаборатории.
3. Каково устройство оптической системы биологического микроскопа?
4. Какие правила необходимо соблюдать при пользовании и уходе за микроскопом?
5. Какие основные формы бактерий вы знаете?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2.

Приготовление микробиологических препаратов для изучения живых микроорганизмов («раздавленная капля» и «висячая капля»). Приготовление мазков из микробных культур.

Любая работа по приготовлению препаратов микроорганизмов, так же как и по пересевам микроорганизмов, проводится с соблюдением правил асептики.

Оборудование лабораторного стола.

Для работы с микроорганизмами требуется определенное оборудование. На рабочем лабораторном столе должны быть спиртовка или газовая горелка, бактериологическая петля, предметные и покровные стекла, набор красок, микроскоп, салфетка, кедровое масло, пинцет, кювета с мостиком, сосуд с водой, песочные часы, карандаш по стеклу, фильтровальная бумага.

Цель занятия.  

Ознакомиться с методами исследования бактерий на подвижность.

Материальное обеспечение.

Молодые бульонные культуры микроорганизмов в пробирках для исследования на подвижность, предметные и покровные стекла, предметные стекла с луночкой, бактериологические петли, пастеровские пипетки, микроскопы, спички, спиртовые или газовые горелки.

Рекомендации по выполнению работы.

Преподаватель должен продемонстрировать технику приготовления неокрашенных препаратов микроорганизмов, подготовку микроскопа к работе, регулирование освещенности поля зрения, установку увеличителя, технику микроскопирования препаратов.

Во время работы студентов преподавателю следует постоянно проверять освещенность поля зрения в каждом микроскопе, в необходимых случаях помочь отрегулировать ее и посмотреть изображения найденных объектов. Просмотру неокрашенного препарата следует уделить особое внимание, так как студенты должны видеть здесь и форму клеток, и их подвижность.

Задания.

1. Приготовить препараты «раздавленная и висячая капля» для определения подвижности бактерий.
2. Приготовить мазок из микробной культуры.
3. Изучить технику микроскопирования и посмотреть приготовленные препараты под микроскопом.
4. Составить отчет по результатам микроскопирования.
5. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Порядок выполнения

1. Исследование подвижности микробов в препаратах «раздавленная и висячая капля».

 Раздавленная капля.

Если организмы находятся в жидкой среде, капля суспензии наносится на обезжиренное предметное стекло с помощью стерильной пипетки. (Пипетка после употребления сразу же помещается в фарфоровый стакан с дезинфицирующим раствором. Класть грязную пипетку на рабочий стол недопустимо!). Если же культура выращена на твердой питательной среде, то на стекло предварительно наносят каплю воды, а затем помещают в неё клетки микроорганизмов или исследуемую пробу тестируемого продукта бактериологической петлей, прокаленной в пламени горелки, и тщательно размешивают.

Каплю жидкости накрывают покровным стеклом. Чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха, покровное стекло сначала ставят на предметное стекло одним ребром, а затем плавно опускают, прижимая «раздавливая» при этом каплю. Желательно избегать избытка жидкости, чтобы суспензия микроорганизмов не выдавливалась из-под покровного стекла. Если это произошло, лишнюю жидкость удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Использованную бумагу следует сразу же поместить в дезинфицирующий раствор.

Для микроскопирования препарата «раздавленная капля» используют только объективы с сухой системой, то есть без иммерсии. Этот вид препарата позволяет установить форму клеток, их размер, способ спорообразования, а если клетки живые, то и наличие или отсутствие подвижности.

Достоинство препарата – получается тонкий слой жидкости, где можно увидеть живые организмы.

Недостаток – быстро высыхает, и движение прекращается, часто попадает воздух, что нарушает микроскопическую картину.

Для приготовления препарата «висячая капля» на покровное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизмов, переворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Если предстоят многодневные наблюдения, то края лунки смазывают вазелином и капля оказывается герметически заключенной во влажной камере. Препарат «висячая капля» используют для выявления подвижности у микроорганизмов, изучения способов размножения, наблюдения за прорастанием спор.

Для приготовления препарата-мазка исследуемую культуру микроба осторожно распределяют равномерным тонким слоем на предметном стекле. При приготовлении культур выросших на плотных средах, поступают следующим образом. На чистое предметное стекло стерильной пипеткой или бактериологической петлей наносят каплю стерильной водопроводной воды или физиологического раствора.

а) Берется пробирка с культурой, из которой необходимо приготовить мазок. Бактериологическую петлю прокаливаем в пламени горелки, держа её в вертикальном положении.

б) Зажав пробку между мизинцем и ладонью правой руки, вынимаем её из пробирки и держим концом вниз, не допуская соприкосновения с рукой той части пробки, которая находилась в пробирке.

в) Открытый конец пробирки обжигаем на пламени.

г) Вводим в пробирку петлю (ещё раз проведенную через пламя), охлаждаем прикосновением к стенке пробирки и набираем небольшое количество материала, слегка прикасаясь к культуре и не царапая среду петлей.

д) Края пробирки и конец ватной пробки обжигаем над пламенем горелки.

е) Пробирку закрываем ватной пробкой.

ж) Взятый материал эмульгируют в имеющийся на предметном стекле капле и равномерно тонким слоем петлей распределяют по поверхности (1,5 х 2 см).

з) Петлю прокаливают и кладут на место.

Если культура выращена в жидкой питательной среде, то стерильную петлю опускают в жидкость, захватывают каплю и растирают на предметном стекле.

3.Техника микроскопирования.

Помещают микроскоп на рабочем столе от края на 3-5 см тубусодержателем к себе.

  Устанавливают хорошее равномерное освещение поля зрения микроскопа, для чего, глядя в окуляр, зеркалом направляют луч света от источника в объектив. Конденсор должен быть поднят вверх, а диафрагма открыта. Поле зрения микроскопа должно быть хорошо и равномерно освещено во всех точках.

На предметный столик помещают исследуемый препарат мазком или каплей вверх и закрепляют клеммами.

Неокрашенные препараты микроскопируют с объективами х8 и х40, опуская конденсор на 1- 0,5 см до препарата, добиваются наилучшей видимости неокрашенных клеток.

При микроскопировании «живых» микробов (неокрашенный препарат) отметить подвижность.

4.Отчет по результатам микроскопирования.

а) система микроскопирования;

б) микроскопируемая культура;

в) рисунок клеток под микроскопом (указать наличие спор, капсул, почек, подвижность).

5.Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Какова техника приготовления препаратов «раздавленная и висячая капля»?
2. Какова методика приготовления мазка из культуры бактерий, выращенных на плотной питательной среде?
3. Что позволяет установить препарат «раздавленная капля»?
4. Для каких исследований используют препарат «висячая капля»?

ЛАБОРАТОРНАЯ  РАБОТА №3.

Приготовление окрашенных препаратов бактерий.

Цель занятия. 

Научиться готовить и окрашивать бактериальные препараты простым методом и по методу Грама.

Материальное обеспечение.

Набор готовых растворов красок во флаконах, набор сухих красок во флаконах или в пробирках с резиновыми или корковыми пробками: основной и кислый фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, сафранин,  малахитовая и бриллиантовая зелень, смесь микробов: культуры грамположительных бактерий (Bac. subtilis, Staph. saprophyticus), грамотрицательных микробов  (E.  coli), выращенных на скошенном МПА, предметные стекла, раствор водного фуксина (фуксин Пфейффера), бактериологические петли, фильтровальная бумага, микроскопы, спиртовые или газовые горелки.

Рекомендации по выполнению работы.

Преподаватель должен продемонстрировать технику приготовления окрашенных препаратов микроорганизмов, подготовку микроскопа к работе, регулирование освещенности поля зрения, установку увеличителя, технику микроскопирования препаратов.

Во время работы студентов преподавателю следует постоянно проверять освещенность поля зрения в каждом микроскопе, в необходимых случаях помочь отрегулировать её и посмотреть изображения найденных объектов. При просмотре окрашенного препарата студент должен видеть наличие спор и капсул у микроорганизмов.

Задания. 

1. Приготовить мазок из зубного налета и окрасить простым методом.  
2. На одном предметном стекле приготовить мазок из смеси стафилококка и кишечной палочки и окрасить по Граму.
3. Просмотреть с иммерсионным объективом окрашенные мазки.
4. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

               Ответить на контрольные вопросы.

Пояснение к работе

Для изучения формы микробной клетки и некоторых её структур препарат (мазок) из материала, содержащего исследуемый микроб, окрашивают.

Большинство микробов быстро и хорошо окрашиваются растворами анилиновых красителей. По химическим свойствам их принято делить на основные и кислые. У основных красителей хромофором (ион, придающий окраску) является катион, у кислых – анион.

К основным красителям относятся красные – нейтральный красный, фуксин основной, сафранин, тионин, пиронин, гематоксилин; синие – метиленовый синий; фиолетовые – кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый; зеленые – малахитовый зеленый, метиленовый зеленый. Основные красители, как правило, легко связываются с ядерными (кислыми) компонентами клеток.

К кислым красителям относятся красные и розовые – фуксин кислый, эозин; желтые – пикриновая кислота, конго, флуоресцен; черные – нигрозин. Кислые красители более интенсивно окрашивают (основные) компоненты клеток.

Приготовление рабочих растворов красок. Прежде чем приготовить рабочие растворы красок, предназначенные для окрашивания микробов, часто заблаговременно из сухих красок, предназначенные для окрашивания микробов, часто заблаговременно из сухих красок готовят насыщенные спиртовые растворы. Для этого краску заливают 96%-ным спиртом в соотношении 1:10. При таком соотношении спирт насыщается краской (нерастворенная часть красок выпадет в осадок). С целью экономии рекомендуется брать на 100 см³ спирта метиленового синего 7,0, генцианвиолета 4,8, основного фуксина 8,1.

Для лучшего насыщения спиртовые растворы помещают в термостат и выдерживают до полного растворения красок. Из насыщенных спиртовых растворов по мере надобности готовят водные рабочие растворы.

Наиболее часто употребляют следующие растворы красителей:

Карболовый раствор фуксина Циля. К 100 мл 5%-го раствора кристаллической карболовой кислоты добавляют 10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина основного. Насыщенный раствор фуксина получают при смешивании 8 г кристаллов фуксина в 10 мл спирта. Краска имеет красный цвет.

Фуксин Пфейффера представляет собой карболовый раствор фуксина  Циля, разведенный в дистиллированной воде 1:10. Готовится непосредственно перед использованием. Краска имеет насыщенный розовый цвет.

Карболовый раствор генцианвиолета. К 10 мл насыщенного спиртового раствора краски добавляют 100 мл 2%-го водного раствора карболовой кислоты. Насыщенный раствор получают, растворяя 1г кристаллического генцианвиолета в 10 мл 96%-ного спирта. Краска имеет сине-фиолетовый цвет.

Сафранин. Готовят непосредственно перед использованием, добавляя к 100 мл горячей воды 1г сафранина. Краска имеет красно-коричневый цвет.

Метиленовая синяя (синька Леффлера). Готовят, добавляя к 100 мл дистиллированной воды 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл 1%-го водного раствора КОН или NaOH. Раствор имееи темно-синий цвет.

Малахитовая зелень. 1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют. Раствор имеет сине-зеленый цвет.

Раствор Люголя. Берут 1г кристаллического йода и 2г йодистого калия на 300 мл дистиллированной воды. Сначала в небольшом количестве воды растворяют йодистый калий, а затем прибавляют кристаллы йода. После полного растворения добавляют остальную дистиллированную воду.

Сложные способы окраски применяют для детального изучения структуры клетки, а также для дифференциации одних микроорганизмов от других. Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения клетки и её частей. Наибольшее практическое знание имеет окраска по Граму, позволяющая дифференцировать бактерии по химическому  составу и структуре клеточной стенки.

   Метод был разработан датским ученым Христианом Грамом в 1885 г. При окраске по методу  Грама все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

Порядок выполнения

Методика окраски по Граму.

1.Метод простой окраски. При простом методе окраски используется один какой-нибудь красящий раствор, чаще всего фуксин Пфейффера или метиленовый синий.

На фиксированный препарат помещают пипеткой несколько капель красящего раствора так, чтобы покрыть всю поверхность мазка: фуксин Пфейффера на 1-2 мин, метиленовый синий на 3-5 мин. Затем краску смывают водой, а мазок просушивают между листочками фильтровальной бумаги или на воздухе.

2.Сложные методы окраски применяют с целью диагностики, выявления отличительных структур микробов в случаях, когда последние не окрашиваются простым способом.

Для дифференциации микробных клеток, различающихся химическим составом и структурой клеточных стенок, используется сложный метод окраски – окраска по Грамму.

 По окраске по Грамму все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

У грамположительных бактерий (Г+) толщина клеточной стенки составляет 15-80 нм, состоит из пептидогликана (от 60-90%), расположенного в несколько слоев, белка (около 1%) и липидов (около 1%). Обнаружены полимеры особого типа – тейхоевые кислоты, ковалентно связанные с пептидогликаном. Большое содержание пептидогликана обеспечивает при окраске по Граму образование комплекса  с генциановым фиолетовым и йодом, устойчивого к спирту, вследствие чего они окрашены в сине-фиолетовый цвет.

Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий (Г-) 10-15 нм, но структура её значительно сложнее, чем у грамположительных бактерий. Основу её составляют ориентированные внутренние липиды (10-20%), которые с поверхностно расположенными полисахаридами образуют липополисахаридный слой. На поверхности клеточной стенки мозаично расположены белки и полисахариды. Пептидогликан представлен одним слоем толщиной всего 2-3 нм (около 5-10%), лежит под липополисахаридным слоем и плотно прикрывает протопласт. Из-за большего содержания липидов клеточная стенка грамотрицательных бактерий при окраске по Грамму образует с генциановым фиолетовым и йодом комплекс, разрушаемый при обработке спиртом, вследствии чего клетки обесцвечиваются.

Неодинаковое отношение микроорганизмов к окраске по Граму связано с различиями в структуре и химическом составе клеточной стенки бактерий.

К грамположительным микроорганизмам относятся кокки, бациллы (спорообразующие палочки), актиномицеты, микобактерии, клостридиальные бактерии.

К грамотрицательным микроорганизмам относятся: бактерии (неспорообразующие палочки), спириллы, сальмонеллы, E coli, псевдомонады, азотбактер, вибрионы.

Имеются грамвариабельные микроорганизмы, отношение которых к окраске по Граму меняется на определенных этапах их жизненного цикла. Так как способность клеток окрашиваться по Граму зависит от их возраста, для окраски по Граму используют клетки молодой культуры, чаще односуточной. Для сравнения одновременно с определяемым объектом целесообразно окрашивать клетки микроорганизмов, отношение которых к окраске по Грамму известно (контроль).

Окраску по Грамму осуществляют следующим образом:

1. Готовят на предметном стекле три мазка культуры микроорганизмов: в центре – мазок исследуемой культуры, слева и справа – мазки контрольных микроорганизмов.

        Мазки должны быть тонкими, чтобы клетки равномерно были распределены по поверхности стекла и не образовывали скоплений, так как от толщины мазка могут зависеть результаты окрашивания. Высушивают мазки на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.

1. Окрашивают мазки карболовым генциановым фиолетовым.    На мазки наносят достаточное количество красителя, выдерживают 1-2 мин, краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором Люголя до почернения (приблизительно 1-2 мин).
2. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 0,5-1 мин (строго) 96%-ным этиловым спиртом путем погружения в стаканчик со спиртом или путем нанесения спирта на мазки (от времени обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработке все бактерии сохраняют окрашивание, при чрезмерной – обесцвечиваются).
3. Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1-2 мин водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.
4. Микроскопируют препарат с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваютя в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный или розовый цвет фуксина (цвет дополнительного красителя).

Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов (по Крегенсену).

Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бактерий в щелочной среде и определении свободной ДНК.

На предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора КОН, в которую вносят бактериальной петлей исследуемые бактерии (24-часовая культура со скошенного агара) и хорошо перемешивают петлей.

Через 5-10 с при передвижении петли по стеклу при положительной реакции в результате тестирования грамотрицательных бактерий образуется слизистый след длиной 1-2 см. Если слизь не образуется, то реакция отрицательная, тогда тестируется грамположительная культура.

3. Отчет по результатам микроскопирования.

а) система микроскопирования;

б) микроскопируемая культура;

в) рисунок клеток под микроскопом (указать наличие спор, капсул).

4. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Какие растворы красителей используют при простом методе окраски?
2. Опишите методику окраски бактерий по Граму.
3. Почему бактерии по разному воспринимают окраску по методу Грама?
4. Какие бактерии относятся к грамположительным, а какие к грамотрицательным?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4

Питательные среды и техника их приготовления.

Цель занятия.

Овладеть техникой приготовления питательных сред.

Материальное обеспечение.

Сухие питательные среды, среды, готовые к употреблению, электроплитка, посуда для варки сред, индикаторная бумага, 20%-ный едкий натр, 20%-ная соляная кислота, пробирки, пипетки, чашки Петри.

Рекомендации по выполнению работы.

Перед выполнением работы студенты повторяют вопросы питания микроорганизмов, питательные среды, классификацию питательных сред, основные требования к питательным средам.

При выполнении лабораторной работы студенты готовят питательную среду.

Задания.

1. Ознакомиться с пояснением к работе.
2. Приготовить питательную среду (по заданию преподавателя).
3. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Ответить на контрольные вопросы.

Пояснение к работе

В бактериологических лабораториях нельзя обойтись без питательных сред. Для определения вида микроорганизма, обнаружения возбудителя инфекционной болезни, т. е. установления диагноза заболевания, производства специфических  препаратов (вакцин, сывороток), для лечения и профилактики инфекционных болезней, получения антибиотиков, санитарно-микробиологических исследований объектов внешней среды, бактериологического исследования мяса и мясных продуктов прибегают к искусственному выращиванию микроорганизмов на питательных средах.

В лабораториях микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стеклянных пробирках, колбах или других сосудах. Для культивирования in vitro  необходимы субстраты, которые микроорганизмы используют в качестве питательных веществ.

По потребности в питательных веществах все микроорганизмы можно разделить на три группы:

первая группа — неприхотливые, растущие на простых средах (гнилостные, большинство кокковых и других микроорганизмов);

вторая группа —  требующие для своего роста дополнительных питательных веществ: полноценного белка (куриного или сывороточного), витаминов, определенного набора аминокислот, микроэлементов (туберкулезная, туляремийная палочки, лептоспиры и др.);

третья группа – не растущие на искусственных питательных средах, а способные размножаться только внутри живых клеток (вирусы, риккетсии).

К питательным средам предъявляют следующие требования:

1. Они должны содержать источники азота и углерода, неорганические соединения, микроэлементы, а также факторы роста, витамины, в основном группы В.

В качестве универсального источника азота используют пептоны. Пептоны – это продукты гидролизного расщепления мяса или казеина. В них содержатся полипептиды, аминокислоты и основные минеральные вещества.

В качестве универсального источника углерода в питательные среды добавляют углеводы (сахара) – глюкозу, лактозу, сахарозу, органические кислоты – молочную, лимонную и др., многоатомные спирты – маннит, глицерин, сорбит и др.

2. Питательные среды должны иметь определенную реакцию среды. Так, для большинства  кокковых, гнилостных и патогенных микроорганизмов оптимум рН 7,0…7,4, а плесневые грибы, дрожжи, молочнокислые микроорганизмы лучше развиваются при рН 6,0.

3. Питательная среда должна быть стерильной, т.е. не содержать микроорганизмов.

4. Питательная среда должна быть влажной, так как питание у микроорганизмов осуществляется по законам диффузии и осмоса. Многие среды должны быть прозрачными для того, чтобы можно было различить на них рост микроорганизмов и наблюдать за физиологическими изменениями, происходящими в результате их жизнедеятельности.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие и плотные. Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар 2…3%-ной концентрации, для полужидкой – агар-агар 0,2…0,3%-ной концентрации.

По происхождению различают среды естественные и искусственные.

Естественные питательные среды представляют собой продукты животного происхождения (кровь, сыворотка крови, молоко, желчь …) или растительного происхождения (овощи, фрукты, злаковые), которые используют для культивирования микроорганизмов без специальной обработки с полным сохранением их естественных свойств.

Искусственные питательные среды готовят из продуктов переработки растений, мяса, молока, печени и др., часто с добавлением к ним углеводов, поваренной соли, красок и т.п.

Среди искусственных сред выделяют синтетические среды, т.е. среды с точно известным химическим составом. Искусственные питательные среды подразделяются на простые, или обычные, и сложные.

Простые питательные среды служат для культивирования большинства микроорганизмов. Белковой основой всех сред является питательный бульон. Обычно пользуются двумя способами приготовления основного питательного бульона: на мясной воде с добавлением готового пептона – мясопептонный бульон, на переварах продуктов гидролиза исходного сырья с помощью ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена) или кислот, такие среды богаче аминокислотами.

От азотистого состава мясопептонных сред и от степени расщепления белка в мясных и других гидролизатах зависит содержание в среде общего и аминного азота.

Для хорошего роста большинства микроорганизмов необходимо содержание в 100 см бульона не менее 250 … 300 мг общего азота при наличии в этом количестве аминного азота (аминокислот) в среднем около 25…30%.

Наиболее распространенными простыми питательными средами являются мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный желатин (МПЖ).

Мясопептонный агар (МПА) – используют для определения общего количества микроорганизмов.

Основой для всех трех сред является мясная вода, которую готовят из фарша говядины, залитого водой и сваренного в течение 1,5 … 2 часов, профильтрованного и простерилизованного в течение 20 …30 минут при 120˚С.

Мясо-пептонный бульон. К 1л мясной воды добавляют 1% пептона и 0,5% поваренной соли, подщелачивают 10%-ным раствором NaOH до рН 7,4, фильтруют и стерилизуют в течение 15 …20 мин при давлении 0,1 МПа.

Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону добавляют мелко измельченный агар-агар (2…3%), нагревают смесь до расплавления агара, устанавливают рН до 7,2…7,6, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и колбам стерилизуют в течение 20…30 мин при 120˚С.

При необходимости МПА разогревают на водяной бане до полного расплавления. Пробирки укладывают в специальные штативы под углом 10˚ и после застывания получают так называемый скошенный агар, который используют для посевов микроорганизмов. Расплавленный мясо-пептонный агар разливают также в чашки Петри.

Аналогично готовят мясо-пептонный желатин.

Порядок выполнения

2.  Приготовление питательной среды из готовой сухой питательной среды.

Сухие питательные среды. Выпускаются простые, элективные и дифференциально-диагностические сухие питательные среды. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, легко растворяющиеся в воде. Сухие питательные среды выпускаются в стеклянных банках с плотно завинчивающимися крышками.

Такие среды готовят согласно инструкции, растворяя порошок в указанном количестве дистиллированной воды, фильтруют и стерилизуют при температуре 120˚С в течение 20 мин.

Сухой питательный агар готовят следующим образом: к растворенному сухому агару (5 г агара на 100 мл) добавляют в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого экстракта, мясной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20 мин.

3. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные требования к питательным средам?
2. Какие наиболее употребляемые питательные среды, предназначенные для культивирования микроорганизмов, их назначение?
3. Какие компоненты входят в состав простых питательных сред?

Список используемой литературы

1. Градова Н. Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии – М.: ДеЛи принт, 2010.
2. Мармузова Л. В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности – М.: 2005.
3. Мудрецова-Висс К. А. Микробиология, санитария и гигиена – М.: ДЛ, 2010.

«Основы микробиологии, санитарии и гигиены».

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

для учащихся профессии НПО

34.17 Оператор процессов колбасного производства.

__________________________________________________________________

Жукова Любовь Анатольевна, преподаватель специальных дисциплин ГАОУ СПО  города Москвы ТК № 28

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования города Москвы

Технологический колледж № 28

Адрес: Москва, ул. Верхние поля, 27

Сдано в печать 07.02.2012.

Формат бумаги 60х90/16

Тираж 16 экз.

Отпечатано в типографии:

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования города Москвы

Технологический колледж № 28

Адрес: Москва, ул. Кабельная, 2

Тел. 8 (495) 673-54-22

E-mail: 78@prof.educom.ru