Жидкостная цитология руководство

Книга представляет собой руководство- справочник по цитопатологии при исследовании жидкостных препаратов. Издание подготовлено всемирно известными специалистами и предоставляет помощь в интерпретации полученного материала. Наряду с базовыми сведениями о данном методе книга включает главы, посвященные цитологическому исследованию материала, полученного из разных локализаций: мочевых и дыхательных путей, ЖКТ, жидкостей из полостей тела, щитовидной и слюнных желез, ткани легкого, молочной железы, печени и поджелудочной железы, опухолей лимфоидной ткани. Отдельная глава посвящена гинекологической цитологии, для которой жидкостный метод исследования стал стандартом мировой практики. Главы были отредактированы российскими специалистами, вошедшими в редакционный совет издания.
Для цитологов и других специалистов по клинической лабораторной диагностике, а также для клиницистов, использующих данные цитологического исследования в своей практике.

На сегодняшний день перед гинекологией остро стоит вопрос своевременной диагностики рака шейки матки и неоплазий. Самый современный и наиболее точный метод цитологического исследования – жидкостная цитология. Этот способ позволяет выявить злокачественные клетки не только в шейке матки, но и в цервикальном канале, значительно повышая точность анализа.

Стоимость анализа ЖИДКОСТНАЯ ЦИТОЛОГИЯ в нашей клинике —  1620 руб.

Время взятия мазка (соскоба) — 1 минута. Срок изготовления анализа: до 4-х суток

Наши партнеры: лаборатории Хеликс и ЛабСтори  

ЗАПИСЬ ПО ТЕЛЕФОНУ: 8-800-707-15-60 (бесплатный звонок). *Клиника имеет лицензию на взятие анализов 

Что такое жидкостная цитология

Так называют стандартизированную технологию приготовления клеточного (цитологического) препарата, используемого для исследования на рак. Этот анализ — «золотой стандарт» диагностики интраэпителиальных неоплазий со слизистых цервикального канала и влагалищного отдела шейки матки. Результат выдается в рамках классификации Bethesda.

Преимущества жидкостной цитологии перед классическим мазком на цитологию

• Лучшее качество биоматериала, взятого на исследование: клетки сохраняют все свойства, не загрязняются слизью и мертвыми клетками (как при обычном мазке на цитологию), попадают на исследование полностью.
• Благодаря стабилизирующему раствору NovaCyt, собранный материал может храниться довольно долго. Это значит, что результаты будут точными.
• Из одного мазка можно получить сразу несколько препаратов для изучения. Время на изготовление минимальное.
• Анализ допускает применение стандартизированных методик приготовления препарата и его окрашивания.

Традиционный мазок на цитологию из шейки матки дает до 40% ложноотрицательных результатов, поэтому его приходится часто переделывать. Это связано с различными проблемами взятия и приготовления препарата. Классический мазок грязный, плохо прокрашивается, быстро высыхает. Часто его бывает недостаточно для достоверного результата.

Недостаток анализа — он подходит только для выявления атипичных клеток. Выявить воспаление, инфекцию и другие проблемы таким способом невозможно.

Когда назначается

Жидкостная цитология может назначаться врачами в следующих случаях:

• Плановый медицинский осмотр. Рекомендуется проводить 1 раз в год после начала половой жизни;
• При подозрении на рак шейки матки.
• При планировании беременности;
• При бесплодии;
• При нарушениях, сбоях менструального цикла;
• Длительный прием оральных контрацептивов, гормональных препаратов, стимулирующий онкологию;
• Подбор способа предохранения;
• Гинекологические патологии вирусного происхождения (генитальный герпес, папилломавирусная инфекция, вирусные гепатиты, ВИЧ);
• Для оценки проведённой терапии.

Наиболее часто жидкостная цитология проводится для диагностики предраковых состояний. При подозрении на рак органов женской половой системы — это обязательное обследование. Точность процедуры составляет 95% и позволяет обнаружить рак на ранней стадии.

Что показывает

Жидкостная цитология оценивает состояние клеток эпителия: есть ли патология, воспаление, заболевания инфекционного характера. Атипичные клетки в большом количестве – указывают на начальную степень развития рака.

Подготовка

Противопоказания для проведения процедуры:

• Период менструации. Результаты в данный период будут неинформативными. Исследование не проводят за 5 дней до менструации и 5 дней после;
• При воспалительных процессах. Сначала необходимо провести лечение. Желательно подождать некоторое время после лечения, чтобы результат цитологии был более точным;
• Проведение кольпоскопии, биопсии шейки матки. Нужно подождать: 24 часа после проведения кольпоскопии, 3 недели после биопсии.

Для того, чтобы метод жидкостной цитологии был максимально информативным, следует придерживаться нескольких правил:

• Соблюдать половой покой за 48 часов до исследования;
• Прекратить прием антибиотиком, оральных контрацептивов, противовоспалительных препаратов. Исключить использование вагинальных свечей, таблеток, спринцевания. Не использовать тампоны;
• Не мочится за 2 часа до исследования.

Как делают анализ жидкостной цитологии

Анализ проводится быстро и безболезненно. Однако при наличии различных заболеваний, женщина может испытывать дискомфорт: зуд, жжение, легкую боль. Процедура занимает менее минуты. Для проведения исследования женщина раздевается и ложится на гинекологическое кресло.

Специальной щеточкой Cervex-Brush с цервикального канала берут материал для дальнейшего исследования. Для этого совершают вращательные движения, что позволяет получить максимально возможное количество клеток, необходимых для изучения. Цитощетка особой конструкции захватывает поверхностно расположенные клетки слизистой оболочки шейки матки, из цервикального канала, а также из прилегающих участков влагалища.

Далее щетка с полученным материалом помещается в пробирку с особой жидкостью, которая помогает стабилизировать и равномерно распределить клетки и другие элементы (слизь и др). В условиях лаборатории жидкость проходит фильтрацию вакуумом, центрифугой, после чего наносится на стекло и окрашивается по методу Папаниколау. Далее под микроскопом врач-лаборант осматривает клеточный осадок, отмечая при этом: особенности окраски, размер, положение клеток. Вся процедура проводится по технологии NovaPrep.

Расшифровка результатов может занимать от 7-ми дней до 2-х недель. При получении результатов жидкостной цитологии, их нужно обязательно показать гинекологу. Если они покажут что-то опасное, гинеколог даст направление к онкологу.

После анализа

После проведения жидкостной цитологии рекомендуется соблюдать половой покой в течении недели. Не рекомендуется использовать тампоны, спринцеваться. Наличие кровяных выделений (необильных) в первые дни после анализа – вариант нормы. При продолжительных обильных выделениях и других беспокоящих симптомах – стоит обратиться к гинекологу.

Метод жидкостной цитологии способен выявить: предраковые состояния, злокачественные изменения на ранних стадиях. Также результаты диагностики помогут подобрать эффективное лечение, а затем оценить его результативность.

Где сдать жидкостную цитологию в Санкт-Петербурге, цена

Такие анализы делают в гинекологических клиниках. Цена жидкостной цитологии практически везде одинаковое, поэтому нужно отдать предпочтение качеству. Доверять анализам можно только если их брал опытный гинеколог, а само исследование атипичных клеток проводилось в современной лаборатории.

Сдать мазок на жидкостную цитологию в СПБ можно в нашей клинике «Диана». При невысоких ценах мы гарантируем профессиональный подход и достоверность анализов. В нашем медцентре можно получить консультацию опытного гинеколога и при необходимости онколога.

Цитология является полноценным методом морфологической диагностики в онкологии, который наряду с гистологическим исследованием используется как в дооперационной, так и в срочной интраоперационной диагностике, помогает врачу в выборе тактики лечения и определении объема оперативного вмешательства. Расширяется использование цитологического метода в иммуноморфологии и молекулярной генетике [1] Эффективность цитологического метода во многом зависит от правильной организации преаналитического этапа работы: полноценности пунктата с достаточным количеством клеточного материала, своевременной фиксации, условий хранения и транспортировки, окраски, качества приготовления цитологических мазков, а также от квалификации цитолога, оценивающего адекватно приготовленные препараты. Стремление улучшить качество цитологической диагностики и уменьшить недостатки традиционного исследования привели к разработке новой технологии — метода жидкостной цитологии. Использование жидкостных технологий приготовления препаратов дает дополнительные возможности для транспортировки, длительного хранения и архивирования материала, стандартизации приготовления и окраски и применения уточняющих методов диагностики — все это облегчает работу цитолога, улучшая визуализацию клеточного материала.

Новую технологию впервые стали использовать для приготовления гинекологических мазков в 1996 г. в США (Thin Prep, Auto Cyto Prep), чтобы улучшить выявляемость опухолевых и предопухолевых заболеваний шейки матки. С тех пор метод жидкостной цитологии хорошо себя зарекомендовал и успешно используется за рубежом не только в гинекологическом скрининге, но и в диагностике опухолей. В литературе описаны возможности применения жидкостной цитологии в диагностике заболеваний легких, мочевыделительной системы, выпотной жидкости, молочной, щитовидной, слюнных желез [2—7].

В настоящее время производители предлагают большое число приборов для жидкостной цитологии, имеющих разный принцип работы, различную степень автоматизации, разные консервирующие среды. Эти приборы позволяют получить равномерное, тонкослойное распределение материала на небольшом участке стекла, что значительно сокращает время просмотра препарата, а некоторые полностью автоматизируют процессы приготовления и окраски мазков. Вместе с тем полученные на разных приборах препараты имеют свои морфологические особенности, так как на морфологию клеток влияет каким образом и в какую среду взят цитологический материал, какой обработке он подвергался.

Благодаря равномерному распределению клеточного материала на стекле, хорошо визуализирующимся деталям ядра и цитоплазмы, значительному снижению числа элементов воспаления, эритроцитов, артефактов, достигается более тщательный анализ структур клетки. Метод жидкостной цитологии в сравнении с рутинным имеет свои морфологические особенности, которые необходимо учитывать: изменение фона, такие структурные изменения, как преимущественно разрозненное расположение клеток, фрагментация крупных клеточных скоплений, нарушение эпителиально-стромального соотношения, уменьшение размера клеток, отдельные клетки приобретают более округлую или вытянутую форму, разреженный хроматин [8].

Описание особенностей морфологии жидкостных цитологических препаратов при патологическом процессе различных локализаций позволяет накопить необходимый опыт и в целом улучшить качество морфологической диагностики.

Цель настоящего исследования — сравнительный анализ эффективности, точности морфологических особенностей жидкостных цитологических препаратов (Cytospin3, E-Prep Processor, BD TriPath) и традиционных цитологических препаратов.

Для приготовления жидкостных препаратов использовали цитоцентрифугу Cytospin3, «Thermo Scientific Shandon» (Великобритания) и «среду накопления» на основе среды Хенкса, разработанную в отделении онкоцитологии МНИОИ им. П.А. Герцена; аппарат E-Prep Processor и растворы фирм «Han Bi Medical Co., Ltd» (Южная Корея), «BD PrepStain Slide Processor CytoRich System» (США). Клеточный материал вносили в контейнер со стабилизирующей средой, которая предохраняет клетки от повреждения, позволяет хранить материал до нескольких месяцев и использовать при необходимости дополнительных исследований. В основе работы Cytospin3 используется принцип центрифугирования для получения монослоя клеток, располагающихся локально в определенной области стекла («окошке»), при этом осадок жидкости абсорбируется в специальном фильтре. Цитоцентрифуга имеет воронки объемом от 0,3 до 6 мл, что позволяет получить окошко с разной областью просмотра от 6 мм до 24×14 мм. В отделении разработана среда накопления, максимально щадящая клеточный материал. Все цитоспиновые препараты готовились с применением данной среды, однако она не дает возможности длительного хранения (до 48 ч) и не обладает фиксирующими свойствами.

Принцип работы аппарата E-Prep Processor основан на методе двойной мембранной фильтрации, полученный цитологический препарат имеет стандартный размер окошка — 20 мм. Предлагаются 5 видов консервирующих растворов для гинекологических образцов, мочи, мокроты, выпотной жидкости, тонкоигольных аспирационных биоптатов. Для окраски по Папаниколау производилась фиксация в спиртовом растворе в течение 30 мин.

В основе работы прибора фирмы «Becton Dickinson Prep Stain Slide Processor» лежит принцип клеточного обогащения на градиенте плотности и центрифугирования.

В системе BD CytoRich для негинекологического материала используется фиксатор, который содержит этанол, поэтому окраска возможна только по Папаниколау.

BD CytoRich Blue используется тогда, когда эритроциты необходимо сохранить для диагностических целей при исследовании мокроты, мочи и смывов мочевого пузыря. BD CytoRich Red способствует денатурации белков и лизису эритроцитов и используется при исследовании пунктатов солидных опухолей.

Цитологический материал исследовали от 112 больных с патологическим процессом различных локализаций: 31 — выпотная жидкость, 22 — опухоли костей и мягких тканей, 20 — опухоли молочных желез, 7 — слюнных желез, 9 — легких, 5 — щитовидной железы и 18 — измененные лимфатические узлы. Материал получен методом тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем УЗИ или взят отпечаток, или соскоб во время операции. Часть материала помещалась непосредственно на стекло для приготовления традиционных мазков. Оставшийся клеточный материал помещали в раствор (среда накопления) для приготовления с помощью цитоцентрифуги Cytospin3 («Thermo Scientific Shandon»), в растворы (фирмы «Han Bi Medical Co.») для аппарата Е-Prep Processor и систему BD CytoRich. Традиционные и жидкостные микропрепараты окрашивали по Паппенгейму и Папаниколау. При оценке препаратов анализировались клеточность, фон, структурный компонент, наличие монослоя, изменения в ядре и цитоплазме. Достоверность цитологического исследования оценивали путем гистологических сопоставлений. Иммуноцитохимическое исследование проводили с использованием системы визуализации Ultra Vision LP («Thermo Scientific», Великобритания) и антител к BerEp4, CK7, CK19, CK20, ER, PR, HER2, vimentin, ЭМА, CD99, Ki-67, S100, СВ68, СВ57, CA125, WT1, HBME1, Carcinoembrionic Antigen, p63, PSA, гладкомышечному актину, TG, ТПО производства «Dako» (Дания) и «Novocastra» (Великобритания). Иммунофлюоресцентное цитохимическое исследование проводили с антителами BerEp4 («Dako»).

Аппараты для жидкостной цитологии позволяют получить тонкослойное, равномерное распределение материала на стекле разными способами: Cytospin 3 — цитоцентрифугирование, E-Prep Processor — двойная мембранная фильтрация и преципитация, BD Prep Stain Slide Processor — клеточное обогащение на градиенте плотности и центрифугирование. Цитоцентрифугирование — простой, удобный и нетрудоемкий ручной способ приготовления жидкостных цитологических препаратов. Достаточно 5 мин для приготовления 12 препаратов. Быстрота приготовления препаратов дает возможность применения ее в срочной интраоперационной иммуноцитохимической диагностике выпотной жидкости. Технология цитоцентрифугирования обеспечивает индивидуальный подход к каждому образцу, учитывая концентрацию клеточного материала в питательной среде. Конструкция цитоцентрифуги позволяет использовать суспезию клеток, помещенную в транспортную среду других фирм-производителей, можно при необходимости использовать растворы, лизирующие эритроциты и удаляющие слизь, однако чем больше этапов обработки проходят клетки, тем сильнее меняется их морфология. Применение Cytospin3 в сочетании со «средой накопления» позволило максимально сохранить морфологию клеток, что приближает Cytospin-препараты к традиционным мазкам, но остаточный фон в единичных случаях затрудняет просмотр клеток. Маленький размер «окошка» — 6 мм — позволяет сделать достаточное количество препаратов для большого числа маркеров при иммуноцитохимическом исследовании, что актуально при небольшом количестве материала, получаемого при тонкоигольной аспирационный биопсии. Положительным моментом цитоцентрифуги является возможность применения любых методов окраски, проведение иммуноцитохимических реакций, в том числе иммунофлюоресцентных, и использование для FISH (флюоресцентная in situ гибридизация) реакций.

В процессе работы прибора E-Prep Processor выявлены следующие достоинства: малые габариты, простота в работе, удобен при небольшом потоке анализов. Высокая скорость работы E-Prep Processor (в течение 23 с можно приготовить 2 препарата) позволяет использовать прибор в срочной интраоперационной диагностике. Для этого метода приготовления цитологических препаратов характерно тонкослойное распределение материала на стекле, клетки сконцентрированы в одном месте, чистый фон — все это позволяет рассмотреть детали ядра и цитоплазмы, возможна окраска по Романовскому, по Папаниколау и выполнение иммуноцитохимии. Однако морфология клеток отличается от традиционной, в части случаев отмечался легкий лизис железистого эпителия, лимфоидные элементы не попадали в препарат. Чистый фон или значительное его снижение (изменение) в отдельных случаях лишает цитолога важной диагностической информации. Клеточные структуры более рыхлые, уплощенные, разбиты на более мелкие, много клеток расположено разрозненно. Широкое окошко (20 мм) стандартного размера не позволяет приготовить достаточное количество препаратов из тонкоигольных биоптатов, но его удобно использовать при большом количестве полученного материала, например, при исследовании жидкости из серозных полостей, мочи, мокроты.

Прибор фирмы «Becton Dickinson Prep Stain Slide Processor» и предохраняющая среда в системе BD CytoRich, с одной стороны, обеспечивают стандартное приготовление препаратов и окрашивание, с другой — не позволяют использовать реактивы других фирм-производителей и «среду накопления». Поскольку в состав транспортной среды входит фиксатор на основе этанола, окрашивание происходит только по Папаниколау, проведение иммуноцитохимических реакций возможно только после соответствующей предварительной обработки препаратов. Стандартное «окошко» — 13 мм. Прибор работает в полуавтоматическом режиме, требует определенных затрат времени и труда персонала в преаналитическом периоде (табл. 1).

Цитологический материал в результате действия растворов и обработки (центрифугирование, разделение в градиенте плотности) меняет свою исходную структуру: удаляется бо`льшая часть фоновых элементов, клетки уменьшаются в размере и изменяются по форме, образуются трехмерные структуры, изменяется эпителиально-стромальное соотношение в сравнении с традиционными цитологическими мазками.

Сравнение морфологических характеристик клеток в жидкостных и традиционных мазках осуществлялось по следующим параметрам: фон, клеточность, морфологические особенности плоского и железистого эпителия, структурный компонент, эпителиально-стромальное соотношение (табл.2).

Благодаря равномерному расположению клеточных элементов в жидкостных препаратах, маленькому «окошку» и чистому фону гораздо быстрее и легче анализировать полученный материал в сравнении с традиционными мазками.

При исследовании 31 выпотной жидкости в 1 (3,2%) случае материал оказался неинформативным. В традиционных и цитоспиновых мазках присутствовали только элементы крови, в E-Prep-препаратах среди элементов крови присутствовали единичные, слегка лизированные клетки мезотелия. У 5 (16%) больных экссудат имел реактивный характер, у 25 (81%) — специфический.

При исследовании выпотной жидкости отмечалось максимальное сходство морфологии традиционных и жидкостных препаратов, так как клетки изначально находятся в жидкой среде. По степени сохранности клеточных элементов и структур Cytospin-препараты превосходят традиционные, а остаточный фон не влиял на результаты морфологического заключения. В E-Prep-препаратах крупные комплексы клеток разбиты на более мелкие, заметно разрозненное расположение большинства клеток, отдельные клетки слегка лизированы. Особенностью BD-препаратов является трехмерное расположение клеточных структур, хорошо представлены детали ядра и цитоплазмы, хорошо визуализируются ядрышки. Во всех случаях диагноз был поставлен и по традиционным, и по жидкостным препаратам. Эффективность составила 96,8% (табл. 3).

При исследовании 18 лимфатических узлов неинформативный материал был в 6,45% традиционных мазков и в 3,2% при параллельном исследовании жидкостных препаратов. При совместном исследовании жидкостных и традиционных препаратов эффективность увеличилась на 3,3% (см. табл.3). В жидкостных препаратах EP и BD отмечалась тенденция к значительному снижению и почти полному отсутствию лимфоидных элементов, поэтому при метастатическом поражении лимфатических узлов в BD- и E-Prep-препаратах можно отметить наличие комплексов клеток аденогенного рака, но нельзя говорить о метастазе в лимфатическом узле, так как лимфоидные элементы отсутствовали. Параллельный анализ традиционного и жидкостного препаратов облегчает морфологическую диагностику благодаря присутствию лимфоидных элементов в традиционном и чистому фону в жидкостных препаратах (BD и E-Prep). В препаратах Cytospin так же, как и в традиционных, лимфоидные элементы сохранялись.

При совместном исследовании жидкостных и традиционных препаратов при опухолях молочных желез (20 исследований) эффективность увеличилась с 85 до 90% за счет снижения процента неинформативного материала (см. табл. 3). В препаратах BD затруднения возникли в дифференциальной диагностике фиброаденомы и высокодифференцированного протокового рака. В жидкостных препаратах разрозненно лежащие клетки рака уменьшены в размере, сморщены и могут быть приняты за стромальный компонент при фиброаденоме; уменьшение размера опухолевых клеток и их деформация могут привести к гиподиагностике рака (рис. 1, см. на цв. вклейке).

При исследовании опухолей костей и мягких тканей (22 исследования) цитологическое заключение по жидкостным и традиционным препаратам совпадало и эффективность составила 71%. Неудачно взятый материал составил 24%, что связано с технической сложностью получения материала неэпителиальных опухолей (см. табл. 3).

При исследовании опухолей легкого (9 больных) возникли трудности в определении степени дифференцировки плоскоклеточного рака по жидкостным препаратам.

В BD-препаратах, согласно критериям классической цитологии, было дано заключение о наличии умеренно-дифференцированного плоскоклеточного рака, в традиционных препаратах морфологическая картина соответствовала малодифференцированному плоскоклеточному раку и совпадала с гистологическим заключением. В случае бронхиолоальвеолярного рака легкого в препаратах BD в сравнении с Cytospin и E-Prep и традиционными мазками лучше представлен важный диагностический признак — сосочкоподобные структуры.

При диагностике опухолей слюнных желез (у 3 больных — плеоморфная аденома, у 2 — аденокистозный рак, у 1 — онкоцитарная карцинома и у 1 — киста околоушной слюнной железы) применение жидкостной цитологии неоднозначно. Диагноз поставлен правильно по рутинным и жидкостным мазкам и соответствовал гистологическому заключению. Рутинные цитологические препараты благодаря максимальной сохранности клеточных элементов и стромального вещества делали постановку цитологического диагноза более легкой. В 1 случае плеоморфной аденомы в полученном материале преобладало мезенхимальное вещество, поэтому клеточные элементы просматривались с трудом. В препаратах, приготовленных в аппарате E-Prep Processor, отмечался более чистый фон за счет уменьшения стромального компонента, клетки располагались разрозненно вне стромального вещества, хорошо просматривались структуры (рис. 2, см. на цв. вклейке).

В 1 исследовании в жидкостном препарате миксоидный фон почти полностью отсутствовал, что затрудняло постановку диагноза плеоморфной аденомы.

При тонкоигольной аспирационной пункции узловых образований щитовидной железы (5) возникли трудности в диагностике аутоиммунного тиреоидита, так как реактивные изменения эпителия щитовидной железы из-за отсутствия лимфоидных элементов могут быть ошибочно приняты за комплексы папиллярного рака (рис. 3, см. на цв. вклейке).

В классической цитологии одним из важных диагностических критериев является оценка клеточности новообразования. В жидкостных препаратах клеточность оценить сложно, так как даже при небольшом количестве клеток в полученном материале на единицу объема в процессе приготовления жидкостных препаратов клетки хорошо концентрируются, что создает ложное впечатление высокой клеточности. В одном случае возникли затруднения в дифференциальной цитологической диагностике коллоидно-паренхиматозного зоба и фолликулярного новообразования щитовидной железы, так как в жидкостных Cytospin-, E-Prep- и BD-препаратах отмечалась высокая концентрация клеток, которые были расположены в виде солидных полей, но не формировались фолликулярные структуры. В другом случае при исследовании образований щитовидной железы традиционный препарат из-за большого числа форменных элементов крови оказался неинформативным, а на основании E-Prep-препаратов удалось поставить диагноз папиллярного рака благодаря хорошей концентрации клеток опухоли, расположения в виде папиллярных структур, наличия внутриядерных включений и бороздок в клетках.

В препаратах BD клетки имеют более вытянутую форму, несколько сморщены и уменьшены в размере по сравнению с Cytospin-препаратами, что продемонстрировано на примере медуллярного рака щитовидной железы, когда отмечается положительная экспрессия кальцитонина в клетках опухоли в BD- и Cytospin-препаратах (рис. 4, см. на цв. вклейке).

Иммуноцитохимическое исследование у 18 больных проведено параллельно на препаратах Cytospin и E-Prep с антителами к BerEp4, CK7, CK19, CK20, ER,PR, HER2, vimentin, ЭМА, CD99, Ki-67, S100, СВ68, СВ57, CA125, WT1, HBME1, CЕА, p63, PSA, гладкомышечному актину, TG, ТПО.

В преобладающем большинстве случаев во всех препаратах, полученных разными жидкостными методами, иммуноцитохимическая экспрессия антител соответствовала клиническим данным и морфологической картине.

В Cytospin-препаратах иммуноцитохимическое исследование, в том числе и иммунофлюоресцентное, проходит ярче по сравнению с препаратами E-Prep и BD, однако присутствие остаточного фона в виде детрита и эритроцитов нередко являлось причиной фонового иммуноцитохимического окрашивания, поэтому в части случаев трудно отличить слабоположительные мембранные и цитоплазменные реакции от фонового окрашивания. В Cytospin-препаратах не всегда удавалось получить равномерное распределение материала в «окошке», крупные плотные комплексы клеток не разбиваются на более мелкие с помощью центрифугирования, из-за чего сложно рассмотреть мембранные и цитоплазменные реакции; краситель скапливается внутри плотных клеточных скоплений, что может привести к ложноположительной оценке реакции. В 3 случаях в Cytospin-препаратах из-за присутствия воспалительно-некротических масс при раке молочной железы и большого числа эритроцитов, а также лимфоидных элементов при метастазе в лимфатическом узле папиллярного рака щитовидной железы иммуноцитохимические реакции оценить не представлялось возможным, исследование удалось провести благодаря E-Prep- и BD-препаратам.

E-Prep- и BD-препараты отличались чистым фоном, реакции четкие, отсутствовало фоновое окрашивание, мешающее оценке реакций. В E-Prep-препаратах в части случаев отмечался легкий лизис клеток, что заметно при флюоресцентном иммуноцитохимическом исследовании: «голые ядра» разрушенных клеток и обрывки цитоплазмы с положительной экспрессией затрудняли оценку реакции. В BD-препаратах флюоресцентное иммуноцитохимическое исследование технически выполнить не удается.

Ядерные реакции в равной степени легко оценивали во всех жидкостных препаратах. Цитоплазменное и мембранное окрашивание сложнее оценивалось в препаратах BD из-за уменьшения клеток в размере и сморщенности. Расположение клеток в разных плоскостях, наличие трехмерных структур в BD-препаратах делает визуальную оценку иммуноцитохимических реакций более сложной по сравнению с E-Prep-препаратами.

Таким образом, все жидкостные способы приготовления препаратов в одних случаях значительно улучшают качество иммуноцитохимического исследования, в других затрудняют оценку реакций или делают ее невозможной. Поэтому необходимо применять индивидуальный подход к каждому исследуемому образцу в зависимости от характера клеточного материала и использовать наиболее оптимальную жидкостную технологию приготовления препаратов для каждого конкретного образца.

Жидкостные технологии приготовления препаратов имеют как достоинства, так и недостатки.

Методы жидкостной цитологии позволяют удалить из препаратов детрит, эритроциты, элементы воспаления, миксоидное вещество. Значительное снижение или отсутствие фоновых элементов, с одной стороны, позволяет сконцентрировать патологические клетки в препарате, детально рассмотреть особенности морфологии ядра и цитоплазмы, с другой — лишает нас важной диагностической информации.

Морфологическая интерпретация жидкостных препаратов представляет определенные трудности, так как различные способы приготовления тонкослойных препаратов, многочисленные этапы обработки материала и разный состав фиксаторов влияют на интенсивность фона, размер и особенности строения клеток и структур, эпителиально-стромальное соотношение, функциональные признаки в клетках.

Морфология жидкостных препаратов отличается от рутинных цитологических препаратов, необходим опыт в просмотре такого материала.

Клеточность препарата является косвенным, но важным признаком в оценке характера опухолевого процесса, этот признак отсутствует в жидкостных препаратах.

Применение жидкостной цитологии позволило повысить эффективность цитологической диагностики, проводить иммуноцитохимическое исследование. Для получения оптимальных результатов иммуноцитохимического исследования необходимо использовать жидкостную технологию применительно к каждому конкретному цитологическому образцу, так как каждый жидкостный метод имеет свои преимущества и недостатки в оценке реакций.

Совместное применение жидкостной и традиционной цитологии позволяет повысить эффективность цитологической диагностики за счет снижения процента неудачно взятого материала, точность остается прежней.

Метод жидкостной цитологии может успешно использоваться в диагностике опухолей молочной, щитовидной, слюнных желез, опухолей мягких тканей, выпотной жидкости, метастазов в лимфатических узлах в сочетании с рутинным методом.

Морфологические критерии препаратов жидкостной цитологии в отечественной и зарубежной литературе для одних локализаций описаны плохо, для других не описаны, поэтому даже опытный цитолог в своем заключении должен опираться на традиционный цитологический препарат до тех пор, пока не будет накоплен достаточный опыт.

бислое либо значительной дисперсией экспериментальных показателей и малым объемом выборки, либо другими причинами, требующими дополнительного изучения.

Выводы. 1. Анемия беременных вызывает увеличение процентного содержания лизофосфатидов, снижает содержание фосфатидилинозитолов и, возможно, компенсаторно увеличивает содержание холестерина и фос-фатидилинозитолов.

2. Степень влияния анемии на снижение содержания общих фосфолипидов составляет 11,1%, а на отношение ОФЛ/ХС — 23,9%.

3. Выявленные изменения не приводят к достоверным изменениям физико-химических свойств мембран и деформируемости эритроцитов, что может свидетельствовать о сбалансированности этих изменений.

ЛИТЕРАТУРА

1. Акоев В.Р., Бобровский Р.В., Жадан Г.Г. и др. Биологические мем-

браны. 1991; 8(1): 78-84.

2. БунакВ.В. Сов. педагогика. 1965; 11: 105-19.

3. Введение в биомембранологию. Учебное пособие. Под ред. А.А.

Болдырева. М.: Изд-во МГУ, 1990.

4. Добрецов Г.Е., Спирин М.М., КарманскийИ.М. Биохимия. 1980;

45(4): 622-8.

5. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток,

мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989.

6. Егуткин Г.Г., Житкович А.В. Биологические науки. 1990; 8: 30-7.

7. Иванова С.В. Вестник ВГМУ 2008; 7(3): 17-23.

8. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975; 76; 138-40; 310-1.

9. Козловский В.И., Атрощенко Е.С., Петухов И.В. Фильтрационные методы исследования деформируемости эритроцитов: Метод. рекомендации. Витебск, 1996.

10. КолбВ.Г., КамышниковВ.С. Справочник по клинической химии. Минск: «Беларусь», 1982.

11. Локтюшкин А.В. Особенности транспорта кислорода через мембрану эритроцитов: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2009.

12. Окунь И.М., Калер Г.В., Волковец Т.М. и др. Биохимия. 1986; 51(7): 1132-40.

13. Самойленко Г.Г., Калер Г.В., Конев С.В. Биофизика. 1999; 44(3): 455-60.

14. Anju Grewal. J. Anaesth. 2010; 54(5): 380-6.

15. Dodje J.T., Mitchell C., Hanahah D.J. et al. Arch. Biochem. 1963; 100(1): 119-30.

16. Oliveira S., Saldanha C. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2010; 44(1): 63-74.

17. Simpson R.J., Florida-James G.D., Whyte G.P. et al. Eur. J. Appl. Physiol. 2007; 99(2): 201-4.

18. SvanborgA., Svennercholm L. Acta Med. Scand. 1961; 169: 43-6.

19. Vaskovsky V.E., KostetskyE.J., Vassenolin J.M. J. Chromatogr. 1975; 114: 129-41.

Поступила 20.10.11

цитология

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616-076.5:008

Н.Н. Волченко, Е.Н. Славнова, А.А. Тугулукова

применение различных вариантов жидкостных технологий в цитологии

ФГБУ московский научно-исследовательский онкологический институт им. п.А. Герцена министерства здравоохранения РФ, москва

Проведено сравнительное исследование традиционных мазков и трех различным жидкостных технологий приготовления цитологических препаратов (CytoSpin3, E-Prep Processor, BD TriPath) на материале, полученном от 112 больных с патологическими процессами различным локализаций — выпотные жидкости (31), мягких тканей (22), лимфатических узлов (18), молочный: желез (20), слюнных желез (7), легких (9), щитовидной железы (5). Установлено, что при совместном применении жидкостной и традиционной цитологии эффективность цитологического исследования повышается на 3,3-5% (в зависимости от локализации патологического очага). Использование жидкостных технологий расширяет возможности применения иммуноцитохимии и молекулярной генетики на цитологическом материале.

Ключевые слова: жидкостная цитология, E-Prep, Cytospin3, BD TriPath, иммуноцитохимическое исследование

N.N. Voltchenko, Ye.N. Slavnova, A.A. Tugulukova

THE APPLICATION OF DIFFERENT TYPES OF LIQUID TECHNOLOGIES IN CYTOLOGY The P.A. Herzen Moscow research oncologic institute of Minzdrav of Russia, Moscow, Russia

The article discusses the results of comparative study of traditional smears and three different liquid technologies of making ready of cytological preparations (CytoSpin3, E-Prep Processor, BD TriPath) using material from 112 patients with pathological processes of such different localizations as exudative liquids (31), soft tissues (22), lymphatic nodes (18), mammal glands (20), saliva glands (7), lungs (9), thyroid gland (5). It is established that under joint application of liquid and traditional cytology the effectiveness of cytological analysis increases up to 3.3%-5% depending on localization of pathologic nidus. The implementation of liquid technologies expands the possibilities of applying immunocitochemistry and molecular genetics to cytological materials.

Key words: liquid cytology, CytoSpin3, E-Prep Processor, BD TriPath, immunocitochemical assay

Жидкостные технологии успешно применяются в клинической цитологии и занимают важное место наряду с традиционным методом, дополняя его и улучшая качество цитологической диагностики. Жидкостную технологию для приготовления гинекологических мазков впервые стали использовать в 1996 г. в США для гинекологического скрининга (Thin Prep), а в 1999 г. введена система SurePath (Becton Dickinson). Метод жидкостной цитологии хорошо себя зарекомендовал и успешно используется за рубежом не только в гинекологическом скрининге, но и в диагностике опухолей. Жидкостные монослойные цитологические препараты получают путем переноса клеточного материала из фиксирующего раствора на стекло с использованием методов центрифугирования, осаждения иили фильтрации. Жидкостная цитология постоянно совершенствуется, появляются новые, полностью автоматизированные системы приготовления препаратов, изменяется состав фиксирующих растворов, обеспечивающих сохранность клеточного материала [5, 7, 16]. Использование жидкостной цитологии позволяет усовершенствовать преаналитический этап цитологического исследования — длительно хранить, транспортировать клеточный материал из отдаленных лабораторий в централизованные, создавать архив и получать тонкослойные цитологические препараты со стандартной областью просмотра. Применение фиксирующих растворов позволяет сохранить клеточную суспензию для дальнейших контрольных и повторных исследований, в том числе для иммуноцитохимии и молекулярно-генетических методов [1, 3, 9, 10, 14]. Качественные стандартизованные цитологические препараты улучшают аналитический этап цитологического исследования, ускоряя и облегчая работу цитолога [2, 3]. В ряде работ проведено сравнение жидкостных цитологических препаратов с традиционными мазками для негинекологических локализаций и показано улучшение качества цитологической диагностики за счет снижения числа неинформативного материала, более чистого фона и лучшей визуализации клеточного материала. В то же время при использовании различных жидкостных техник и способов обработки материала возникают трудности, связанные с правильной трактовкой цитологической картины, так как она существенно отличается от традиционных цитограмм. По мнению одних авторов, жидкостные цитологические препараты можно анализировать самостоятельно, по мнению других — только совместно с традиционным мазком, так как в жидкостных препаратах отсутствует часть диагностически важных признаков [4, 8, 12, 13-15, 17]. Цитоморфологические особенности и трудности, с которыми может столкнуться цитолог в оценке жидкостных препаратов, для одних локализаций описаны мало, для других вовсе не описаны. Однако знание этих особенностей необходимо, так как тонкослойные цитологические препараты могут успешно применяться для проведения уточняющей диагностики,

Для корреспонденции:

Волченко Надежда Николаевна, д-р мед. наук, проф., рук. отд-ния онкоцитологии

Адрес: 125284, Москва, 2-й Боткинский пр., 3 Телефон: (495) 945-43-92 E-mail: mnioict@mail.ru

Таблица 1

Сравнение трех жидкостных технологий приготовления препаратов

Cytospin 3, Thermo Scientific Shandon

E-Prep — процессор, Han Bi Medical Co., Ltd

BD Prep Stain™ Slide Processor

Цитоцентрифугирование

Простота и удобство в работе

Равномерное, тонкослойное распределение материала на стекле, фон более чистый по сравнению с традиционным мазком

Быстрота (5 мин — 12 препаратов)

Разные методы цитологической окраски (Романовский, Папаниколау)

Вариабельный размер окошка

Возможность проведения иммуноцитохимии

Использование сжатого воздуха и мембраны

Простота и удобство в работе

Равномерное, тонкослойное распределение материала на стекле, чистый фон

Быстрота (23 с — 2 препарата)

Клеточное обогащение на градиенте плотности, центрифугирование

Длительный период предподготовки

Равномерное, тонкослойное распределение материала на стекле, чистый фон

За 45 мин делается 48 мазков, за 8-часовой рабочий день можно сделать 288 мазков

Окраска только по Папаниколау

Разные методы цитологической окраски (Романовский, Папа-николау)

Размер окошка 20 мм Размер окошка 13 мм

Возможно проведение иммуноцитохимии

Возможно проведение иммуноцитохимии

поскольку повышают эффективность цитологического исследования [1, 2, 4, 8-10, 12-14, 15, 17].

Цель настоящего исследования — определить возможности применения для цитологической диагностики различные жидкостные технологии (Cytospin3, E-Prep Processor, BD TriPath).

Материалы и методы. Исследовали материал от 112 больных с патологическими процессами различных локализаций: 31 — выпотные жидкости, 22 — мягких тканей, 18 — лимфатических узлов, 20 — молочных желез, 7 — слюнных желез, 9 — легких, 5 — щитовидной железы. Препараты готовились параллельно традиционным способом и методом жидкостной цитологии (часть материала помещалась в «среду накопления» для приготовления мазков с помощью цитоцентрифуги Cytospin3 (Thermo Scientific Shandon), а часть помещалась в фиксирующие растворы для аппарата Е-Prep и системы BD CytoRich). Традиционные и жидкостные микропрепараты окрашивали по Романовскому и Папаниколау. Иммуноцитохимическое исследование проводилось с использованием системы визуализации Ultra Vision LP (Thermo Scientific, Великобритания) и антител к BerEp4, CK7, CK19, CK20, ER,PR, HER2, vimentin, calcitonin, CA125, WT1, HBME1, CEA, p63, TG, ТПО. Использовали первичные антитела производства Dako (Дания) и Novocastra (Великобритания). Флюоресцентное иммуноцитохимическое исследование проводилось с антителами BerEp4 FITC (Dako, Дания).

В нашей работе мы применяли три жидкостные технологии: Cytospin, E-Prep Processor, BD TriPath (табл. 1).

Результаты и обсуждение. Наше исследование показало, несмотря на то, что все аппараты для жидкостной цитологии используют разные физические принципы работы (цитоцентрифугирование, двойная мембранная фильтрация и преципитация, клеточное обогащение на градиенте плотности и центрифугирование), они обладают общими достоинствами, отличающими их от тра-

Таблица 2

Сравнение морфологических характеристик клеток в жидкостных препаратах и традиционных мазках

Критерии

Традиционный препарат

Cytospin 3

E-Prep

BD, TriPath

Фон

Плоский эпителий

Железистый эпителий

Структурный компонент

Эпителиально-

стромальное

соотношение

Имеется

Характерные морфологические признаки

Характерные морфологические признаки

Характерные морфологические признаки

Характерное

Имеется

Характерные морфологические признаки

Клетки имеют более округлую форму. Сохранность цитоплазмы и ядерных признаков

Структуры частично разбиты, больше клеток расположено разрозненно, в сравнении с традиционным препаратом

Клетки равномерно распределены в стромальном веществе

Чистый, большая часть фоновых элементов удалена

Характерные морфологические признаки

Более вытянутая форма клеток, в отдельных — более округлая. Легкий лизис части клеток. Сглаженный рисунок хроматина в ядре

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Структуры более рыхлые, уплощенные, разбиты на более мелкие, много клеток расположено разрозненно

Снижено количество и вид стромального вещества отсутствует. Изменено расположение стромального компонента по отношению к эпителиальному

Чистый, большая часть фоновых элементов удалена

Уменьшение размера клеток

Более вытянутая форма клеток, частью — округлая. Клетки уменьшены в размере. Хорошо представлены детали ядра

Трехмерные структуры, уменьшены в размере. Клетки и структуры расположены в разных плоскостях

Снижено количество и вид стромального вещества/ отсутствует. Изменено расположение стромального компонента по отношению к эпителиальному

Таблица 3

Сравнение эффективности цитологических исследований — жидкостных и традиционных мазков (в %)

Локализация процесса Жидкостной + традиционный Традиционный

Эффектив- Точность Ошибки Неудачный Эффектив- Точность Ошибки Неудачный

ность материал ность материал

Жидкости 96,8 100 — 3,2 96,8 100 — 3,2

Лимфатические узлы 93,6 96,8 3,2 3,2 90,3 96,8 3,2 6,5

Молочная железа 90 95 5 5 85 95 5 10

Мягкие ткани 71 95 5 24 71 95 5 24

диционных цитологических мазков. Применение метода жидкостной цитологии при цитологическом и иммуноци-тохимическом исследованиях показало ряд преимуществ перед рутинным способом приготовления цитопрепара-тов: получение стандартных препаратов высокого качества, возможность получения монослоя клеток, высокая сохранность клеточных структур, уменьшение фона, что позволяет избежать «загрязнения» опухолевых клеток элементами крови и воспаления, облегчая просмотр цитологических препаратов, монослойные препараты хорошего качества позволяют использовать современные компьютерные технологии обработки изображений, проведения морфометрии, иммуноморфологические исследования, клетки сосредоточены в одном месте «окошечке», что практически в 6-8 раз уменьшает расход дорогостоящих реактивов, что особенно важно при иммуноцитохимиче-ских и молекулярно-биологических исследованиях, сокращается время просмотра мазка, нет опасности пересыхания препарата (при окраске по Папаниколау).

В то же время, каждая из жидкостных методик имеет свои особенности, достоинства и недостатки (табл. 1, 2), что показано на ряде конкретных примеров совместного применения традиционного и жидкостных цитологических методик исследования клеточного материала.

При исследовании 31 экссудата из брюшной полости специфический характер экссудатов с наличием комплексов клеток аденогенного рака установлен при использовании всех жидкостных технологий (рис. 1). Наибольшее

сходство в строении клеток и клеточных структур отмечается в традиционных (рис. 1, а) и Cytospin-препаратах (рис. 1, б), а небольшой остаточный фон в виде эритроцитов не влиял на результат цитологической диагностики. В препаратах E-Prep (рис. 1, в) отмечалась фрагментация клеточных структур на более мелкие, большая часть клеток расположена разрозненно, клетки слегка лизированы, в сравнении с традиционными, цитоспиновыми и BD — препаратами (рис. 1, г). Одной из особенностей BD-препаратов является нахождение клеточных элементов и структур в разных плоскостях, в отличие от традиционных, Cytospin- и E-Prep препаратов. В BD-препаратах клетки меньше по размеру, но лучше представлены детали ядра и цитоплазмы, хорошо визуализируются ядрышки за счет окраски по Папаниколау. В E-Prep препаратах отмечается лизис части клеток, могут появляться «голые» ядра разрушенных клеток, что особенно хорошо видно в случае исследования специфической плевральной жидкости, с наличием клеток аденогенного рака, особенно при проведении флюоресцентного иммуноцитохимиче-ского исследования с эпителиальным маркером BerEp4 FITC. Эффективность традиционного цитологического исследования жидкостей из серозных полостей составила 96,8%, эффективность совместного применения жидкостных методик и традиционного исследования составила также 96,8% (табл. 3).

Традиционную и жидкостную технологию применяли при исследовании 18 лимфатических узлов. Особен-

Рис. 1. Асцитическая жидкость, рак яичников. Специфический экссудат с наличием комплексов аденогенного рака. а — традиционный препарат, окраска по Романовскому (Ув. 400); б — препарат Cytospin, окраска по Романовскому (ув. 400); в — препарат Е-Ргер, окраска по Романовскому (ув. 400); г — препарат ВБ, окраска по Папаниколау (ув. 400).

но интересны три случая цитологическои диагностики. В одном случае на основании рутинного цитологического анализа установлен диагноз: метастаз аденогенного рака без признаков органоспецифичности в подмышечный лимфатический узел. Для уточнения источника ме-тастазирования потребовалось проведение иммуноцито-

химического исследования. В Cytospin-препаратах имелись лишь единичные клетки опухоли среди большого числа форменных элементов крови, иммуноцитохими-ческую реакцию по таким препаратам оценить не представлялось возможным. В препаратах, приготовленных с помощью Е-Ргер, клетки хорошо сконцентрированы,

а • — ц

• * •• • « • . * * * I » в . г Я/ 0 1 р*)’ ■■

Рис. 2. Метастаз папиллярного рака щитовидной железы в лимфатический узел.

а — препарат Е-Ргер, окраска по Романовскому (ув. 200); б — Cytospin, окраска по Романовскому (ув. 200); в — Е-Ргер иммуноцитохимия, положительная экспрессия тиреоглобулина (ув. 200); г — Cytospin, иммуноцитохимия, положительная экспрессия тиреоглобулина (ув. 200).

чистый фон, что сделало возможным проведение имму-ноцитохимического исследования. Экспрессия антител к цитокератинам 7, рецепторам эстрогенов, прогестерона позволила установить метастаз рака молочной железы в подмышечный лимфатический узел.

Во втором случае исследовали метастаз высокодиффе-

ренцированного аденогенного рака в лимфатический узел шеи. По препарату Е-Ргер можно сделать заключение о наличии клеток аденогенного рака, но нельзя говорить о метастазе в лимфатический узел, так как лимфоидные элементы отсутствовали, что определяется спецификой приготовления жидкостных препаратов с помощью Е-Ргер-

Рис. 3. Пунктат бронхопульмонального лимфатического узла.

а — традиционный препарат, окраска по Романовскому (ув. 200); б — Е-Ргер-препарат, остались лишь макрофаги. Окраска по Романовскому (ув. 200).

процессора (рис. 2, а). При исследовании лимфатических узлов с помощью Е-Ргер процессора, в большей части наблюдений, лимфоциты не попадали в жидкостной препарат. Параллельный анализ традиционного и жидкостного препаратов облегчает морфологическую диагностику, благодаря присутствию лимфоидных элементов в традиционном препарате (рис. 2, б) и чистому фону в жидкостном Е-Ргер препарате. Концентрация патологических клеток в жидкостном препарате позволяет удачно провести имму-ноцитохимическое исследование. Иммуноцитохимическое исследование в препаратах Е-Ргер (рис. 2, в) и Cytospin (рис. 2, г) с антителами к тиреоглобулину показало положительную экспрессию в клетках метастаза папиллярного рака щитовидной железы. Но в Cytospin-препаратах наличие фона в виде большого числа лимфоидных элементов затрудняло оценку иммуноцитохимической реакции.

Традиционным цитологическим методом и с помощью Е-Ргер процессора исследовали пунктат бронхопульмонального лимфатического узла (рис. 3) с выраженным антракозом и синус-гистиоцитозом. В Е-Ргер (рис. 3, а) препаратах отсутствовали лимфоидные элементы и присутствовали только макрофаги, клеточность ниже в сравнении с традиционными препаратами (рис. 3, б). При исследовании лимфатических узлов в ВБ-препаратах и Cytospin препаратах лимфоидные элементы сохраняются.

Эффективность традиционного цитологического исследования лимфатических узлов составила 90,3%, эффективность совместного применения жидкостных методик и традиционного исследования — 93,6% (табл. 3).

Исследован клеточный материал, полученный от 20 больных с патологией молочных желез. Наиболее наглядными были два случая совместного исследования молочных желез. В одном случае при исследовании пунктата молочной железы наличие выраженного воспалительно-некротического фона затрудняло проведение иммуно-

цитохимического исследования на традиционных и Су-tospin препаратах. В препаратах Е-Ргер отмечался чистый фон, позволяющий рассмотреть клетки, однако клетки опухоли слегка лизированы, имели вытянутую форму. В традиционном препарате клеточные элементы почти полностью разрушены, присутствовали лишь «голые» ядра. Наибольшая сохранность цитоплазмы и ядер опухолевых клеток отмечалась в Сytospin-препаратах, но воспалительно-некротический фон сохранен.

Во втором случае при исследовании ВБ препаратов возникли затруднения в дифференциальной диагностике фиброаденомы и высокодифференцированного протоко-вого рака молочной железы. По традиционному препарату поставлен диагноз высокодифференцированного протокового рака молочной железы, что соответствовало гистологическому заключению (рис. 4, а). В жидкостных ВБ препаратах разрозненно лежащие клетки рака уменьшены в размере, имеют вытянутую форму и ошибочно приняты за стромальный компонент фиброаденомы (рис. 4, б). Следует отметить, что в традиционной цитологии одним из важных диагностических критериев является оценка клеточности новообразования, в жидкостных препаратах оценить клеточность невозможно. Эффективность традиционного цитологического исследования молочных желез составила 85%, эффективность совместного применения жидкостных методик и традиционного исследования — 90% (см. табл. 3).

Совместное исследование традиционных и жидкостных цитологических мазков проводилось в 7 случаях опухолей слюнных желез. Рутинные цитологические препараты, в большинстве случаев, делали постановку диагноза более легкой, благодаря максимальной сохран-

Продолжение см. на стр. 37

Рис. 4. Высокодифференцированный протоковый рак молочной железы.

а — традиционный препарат, окраска по Романовскому (ув. 200); б — ВБ-препарат, окраска по Папаниколау (ув. 200).

Рис. 5. Высокодифференцированная аденокарцинома легкого, бронхиолоальвеолярный рак. а — традиционный препарат, окраска по Романовскому (ув. 400); б — препарат ВБ, окраска по Папаниколау (ув. 400).

ности клеточных элементов и стромального вещества. В одном наблюдении плеоморфной аденомы в полученном материале преобладало мезенхимальное вещество и клеточные элементы просматривались с трудом.

В препаратах, приготовленных в аппарате Е-Ргер, отмечался более чистый фон за счет уменьшения стромаль-ного компонента, клетки располагались разрозненно, вне стромального вещества, хорошо просматривались

Рис. 6. Медуллярный рак щитовидной железы.

а — препарат ВБ, окраска по Папаниколау (ув. 200); б — Сytospin, окраска по Романовскому (ув. 200); в — препарат ВБ, положительная экспрессия кальцитонина в клетках опухоли (ув. 200); г — Сytospin, положительная экспрессия кальцитонина в клетках опухоли (ув. 200).

клеточные структуры. Вместе с тем, в другом исследовании опухоли слюнной железы в жидкостном препарате миксоидный фон почти полностью отсутствовал, что затрудняло постановку диагноза плеоморфной аденомы без традиционного мазка.

Совместное исследование традиционных и жидкост-

опухолей легкого. При исследовании материала из опухоли легкого, возникли трудности в установлении степени дифференцировки плоскоклеточного рака по жидкостным мазкам. В традиционном препарате морфологическая картина соответствовала малодифференцирован-ному плоскоклеточному раку и совпадала с гистологи-

ных цитологических мазков проводилось в 9 случаях ческим заключением. В ВБ-препаратах, руководствуясь

критериями классической цитологии, цитологически поставлен диагноз умереннодифференцированного плоскоклеточного рака. При высокодифференцированной аденокарциноме легкого (бронхиолоальвеолярном раке) одним их важных классических критериев является расположение клеток в виде сосочкоподобных структур, что лучше представлено в жидкостных препаратах ВЬ (рис. 5, а) в сравнении с традиционными цитологическими мазками (рис. 5, б). С другой стороны, клетки бронхиального эпителия, помещенные в жидкость, округляются и структуры могут напоминать сосочки, что при отсутствии клеточного полиморфизма может стать причиной гипердиагностики бронхиолоальвеолярного рака.

Исследовали 5 опухолей щитовидной железы. В одном случае диагноз папиллярного рака щитовидной железы удалось поставить только по жидкостным Е-Ргер препаратам благодаря хорошей концентрации клеток опухоли, расположены в виде папиллярных структур. Традиционный препарат из-за большого числа форменных элементов крови оказался неинформативным. В другом случае в ВЬ-препаратах при медуллярном раке щитовидной железы клетки имеют более вытянутую форму (рис. 6, а), несколько сморщены и уменьшены в размере, по сравнению с Cytospin-препaрaтaми (рис. 6, б). Отмечалась положительная экспрессия кальцитонина в клетках опухоли как в ВЬ, Cytospin-препaрaтaх (рис. 6, в, г).

Исследование традиционным и жидкостным цитологическим методом 22 опухолей мягких тканей показало высокую эффективность их совместного применения 71% (см. табл. 3).

В нашем исследовании иммуноцитохимическое исследование проводилось параллельно на препаратах Cytospin, ВЬ и Е-Ргер в 18 случаях. Более яркая имму-ноцитохимическая экспрессия отмечалась на Cytospin-препаратах по сравнению с препаратами Е-Ргер. Для проведения иммуноцитохимии на ВЬ-препаратах необходима предподготовка. В 3-х случаях, из-за присутствия воспалительно-некротических масс при раке молочной железы и большого числа эритроцитов, лимфо-идных элементов при метастазе в лимфатический узел папиллярного рака щитовидной железы, исследование удалось провести только на препаратах Е-Ргер и ВЬ.

Выводы. 1. Применение жидкостных технологий имеет как преимущества, так и свои ограничения.

2. Все жидкостные препараты имели более чистый фон, тонкослойное, равномерное распределение материала на стекле, в сравнении с традиционными препаратами, что облегчало просмотр материала.

3. Применение жидкостной цитологии позволило повысить эффективность цитологической диагностики, проводить иммуноцитохимическое исследование, транспортировать и архивировать клеточный материал.

4. Морфология жидкостных препаратов отличается от классической цитоморфологии, так как различные способы приготовления тонкослойных препаратов, многочисленные этапы обработки материала и разный состав фиксаторов влияют на интенсивность фона, размер и особенности строения клеток и клеточных структур, эпителиально-стромальное соотношение, функциональные признаки в клетках. Так, изменение морфологии клеток затрудняет дифференциальную диагностику доброкачественного процесса от злокачественного, например, высокодифференцированного протокового рака молочной железы и фиброаденомы. Возникают трудности в оценке степени дифференцировки клеток при мало-дифференцированном плоскоклеточном раке.

5. Высокая или низкая клеточность — косвенный, но

важный признак, на который опирается цитолог в оценке характера опухолевого процесса и этот признак отсутствует в жидкостных мазках. Во всех жидкостных препаратах клетки сконцентрированы, что создает ложное впечатление о высокой клеточности. Если признаки атипии хорошо представлены в клетках, то диагноз можно поставить как во всех случаях жидкостных, так и традиционных препаратов и клеточность не имеет большого значения.

6. Значительное снижение или отсутствие фона, с одной стороны, позволяет лучше рассмотреть клетки, с другой стороны, лишает важной диагностической информации. Отсутствие лимфоидных элементов в жидкостных препаратах Е-Ргер не позволяет предположить о том, что материал получен из лимфатического узла в отсутствие традиционного препарата. Диагноз аутоиммунного ти-реоидита невозможен при отсутствии лимфоцитов в пун-ктате, а реактивные изменения фолликулярного эпителия, при отсутствии лимфоцитов, могут быть ошибочно приняты за клетки фолликулярного рака. Значительное снижение или отсутствие миксоидного фона делает трудной диагностику плеоморфной аденомы слюнной железы.

7. Морфология клеток в препаратах, приготовленных с помощью разных жидкостных техник, отличается между собой. Для трактовки цитологической картины необходимо знать, в какую среду взят материал и на каком приборе приготовлен. Так, морфология клеток в препаратах, полученных методом цитоцентрифугирова-ния с применением «среды накопления», максимально приближена к морфологии традиционных мазков, но сохраняется фон. В препаратах Е-Ргер, клетки и структуры уплощены, крупные скопления клеток фрагментирова-ны, много разрозненно расположенных клеток, в некоторых случаях отмечается легкий лизис железистого эпителия. В ВЬ-препаратах клетки слегка сморщены и уменьшены в размере, имеют более вытянутую форму, структуры имеют трехмерное расположение.

В выпотных жидкостях, когда клетки изначально находились в жидкой среде, отмечалось максимальное сходство морфологии жидкостной и традиционной цитологии. При исследовании соскобов с опухоли и тонкоигольных аспи-рационных биопсий, отличия жидкостных и традиционных препаратов были значительнее, в отдельных случаях отсутствовали важные диагностические критерии.

9. Все жидкостные технологии позволили провести иммуноцитохимическое исследование.

10. Благодаря чистому фону и более равномерному распределению клеток в препарате, реакции в препаратах Е-Ргер оценить оказалось легче. Реакции в Cytospin-препаратах проходили ярче, но остаточный фон и элементы крови, в некоторых случаях затрудняли оценку препарата.

11. Совместное применение жидкостной и традиционной цитологии позволяет повысить эффективность цитологической диагностики за счет снижения процента неудачно взятого материала. Точность исследования оставалась прежней на нашем материале.

12. Таким образом, все жидкостные технологии ^у-tospin, Е-Ргер, ТлРаШ ВЬ) могут успешно использоваться в диагностике опухолей молочной железы, щитовидной, слюнных желез, опухолей мягких тканей, вы-потных жидкостей, метастазов в лимфатические узлы в сочетании с классическим цитологическим методом.

13. Морфологические критерии препаратов жидкостной цитологии в литературе описаны недостаточно, поэтому пока не будет накоплен опыт обязательно параллельно с жидкостным должен анализироваться традиционный препарат.

ЛИТЕРАТУРА

1. Волченко Н.Н., Савостикова М.В. Атлас цитологической и им-муноцитохимической диагностики опухолей. М.: Репроцентр М, 2010.

2. Назарова И.В., Родионова О.М., Волков М.В., Богатырев В.Н. Первый опыт использования аппарата Е PREP для жидкостной цитологии в России. Новости клинической цитологии России. 2012; 16(1-2): 3-5.

3. Шабалова И.П., Касоян К.Т., Савостикова М.В. Жидкостная цитология в клинической практике (лекция). Клиническая лабораторная диагностика. М., 2011; 12: 25-35.

4. Al-Khafaji B.M., Afify A.M. Salivary gland fine needle aspiration using the ThinPrep technique: diagnostic accuracy, cytologic artifacts and pitfalls. Acta Cytologica. 2001; 45(4): 567-74.

5. Esquivias Lopes-Cuervo J., Montalban Beltran E., Cuadros Lopez J.L., Alonso Castillo A., Nieto Sanchez T. Preliminary Study of a New, Fully Automated System for Liquid-Based Cytology: The NovaPrep® Processor System. Acta Cytologica 2011; 55: 281-6.

6. Geers C., Bourgain C. Liquid-based FNAC of the thyroid: a 4-year survey with SurePath.Cancer Cytopathology. 2011; 119(1): 58-67.

7. Jae Soo Koh M.D., Cytology Evaluation of Cell prep LBC in Cytology specimens. The Korean Journal of Cytopathology. 2007; 18(1).

8. Jung C.K., Lee A., Jung E.S., Choi Y.J., Jung S.L/, Lee K.Y. Split sample comparison of a liquid-based method and conventional smears in thyroid fine needle aspiration. Acta Cytologyca. 2008; 52(3): 313-9.

9. Konofaos P., Kontzoglou K., Georgoulakis J. et al. The role ThinPrep cytology in the evaluation of estrogen and progesterone receptor content of breast tumors. Surg. Oncol. 2006; 15: 257-66.

10. Lukas Burendorf. Multiprobe fluorescence in situ Hybridization (UroVysion) for the detection of urothelial carcinoma — FISHing for the right catch. Acta Cytologica. 2011; 55: 113-9.

11. Malapelle U., de Rosa N., Rocco D., Bellevicine C., Crispino C., Illiano A. et al. EGFR and KRAS mutations detection on lung cancer liquid-based cytology: a pilot study. J. Clin. Pathol. 2011; 65(1): 87-91.

12. Michael C.W., McConnel J., Pecott J., AfifyA.M., Al-Khafaji B. Comparison of ThinPrep and TriPath PREP liquid-based preparations in nongynecologic spesimens: a pilot study. Diagnostic Cytopathology. 2001; 25(3): 177-84.

13. Rana S., HodaM.D. Non-gynecologic cytology on liquid-based preparations: a morphologic review of facts and artifacts. Diagnostic Cytopathology. 2007; 35: 621-34.

14. Rieko Nishimura, Kenjiro Aogi, Tamami Yamamoto, DaisukeTakabat-ake, Seiki Takashima, Norihiro Teramoto et al. Usefulness of liquid-based cytology in hormone receptor analysis of breast cancer spesim-ens. Virchows Arch. 2011; 458: 153-8.

15. Rossi E.D., Mule A., Russo R.M., Pierconti F., Fadda G. Application of liquid-based preparation to non-gynaecologic exfoliative cytology. Pathologica. 2008; 100(6): 461-5.

16. Seung-Myoung Son, Ji Hae Koo, Song-Yi Choi, Ho-Chang Lee, Yong-Moon Lee, Hyung Geun Song et al. Evaluation of urine cytology in urothelial carcinoma patients: a comparison of CellprepPlus® Liquid-Based Cytology and conventional smear. The Korean Journal of Pathology. 2012; 46: 68-74.

17. Yi-Bo Fan, Qing-Shan Wang, Lin Ye, Tian-Yu Wang, Guang-Ping Wu. Clinical application of the SurePath liquid-based Pap test in cytological screening of bronchial brushing for the diagnosis of lung cancer. Cyto-technology. 2010; 62: 53-9.

Поступила 07.02.13

микробиология

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.835.12.083.134

Г.Ш. Исаева1, В.А. Алешкин2, Е.П. Селькова2, М.С. Герасимова3, П.И. Мороз3

двухфазная питательная среда Для сУБКУльтивировАния HELiCOBACTER PYLORi

1ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии Республики Татарстан» Казань; 2Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора; Республиканский клинический онкологический диспансер Минздрава Республики Татарстан, Казань

H. pylori — очень прихотливый микроорганизм, нуждающийся в создании комплекса условий, включающих определенную атмосферу, температуру культивирования и состав питательной среды. Рекомендована двухфазная среда для субкультивирования на чашках Петри диаметром 90 мм, состоящая из шоколадного агара с добавлением бульона Шедлера, обогащенного 10% сывороткой крупного рогатого скота.

Ключевые слова: Helicobacter pylori, субкультивирование, двухфазная питательная среда G.Sh. Isayeva, V.A. Aleshkin, Ye.P. Selkova, M.S. Gerasimova, P.I. Moroz

THE TWO-PHASE GROWTH MEDIUM FOR SUB-CULTURING OF HELICOBACTER PYLORI

A.Pylori is a very undemanding microorganism needing the in support of complex of conditions including particular atmosphere, temperature of culturing and composition of growth medium. The two-phase growth medium is recommended to sub-culturing in Petri dishes with diameter of 90 mm. The growth medium consists of chocolate agar with addition ofS^edler broth and enriched with 10% serum of cattle.

Key words: Helicobacter pylori, sub-culturing, two-phase growth medium Инфекция

Для корреспонденции:

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Исаева Гузель Шавхатовна, канд. мед. наук, доц. каф. микробиологии

Адрес: 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49 Телефон: (843) 236-06-52 E-mail: guisaeva@rambler.ru

Helicobacter pylori — одна из самых распространенных в мире. Для диагностики хеликобактериоза разработано множество методов, одним из которых является бактериологическое исследование. Трудоемкость и сложность выделения H. pylori ограничивает применение этого метода в рутинной практике практического здравоохранения, но он остается единственным для фенотипического определения чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам. Мониторинг за

Жидкостная цитология – современный метод определения раковых и предраковых состояний шейки матки. Это исследование широко применяется при диагностике различных патологических процессов шейки матки.

Результаты жидкостной цитологии в гинекологии позволяют определить имеющиеся заболевания и подобрать оптимальный вариант консервативного и хирургического лечения.

Как часто сдавать жидкостную цитологию

Это исследование рекомендуется проходить всем женщинам даже при отсутствии симптомов неблагополучия со стороны половой системы. Диагностика проводится с 21 года или через 3 года после начала половой жизни.

Периодичность прохождения жидкостной цитологии зависит от возраста пациентки:

• До 29 лет исследование проводится раз в 3 года.
• С 30 до 69 лет – ежегодно. В случае, если в течение 3 лет подряд в мазках не было выявлено никаких патологических процессов, в следующий раз жидкостная цитология проводится через 3 года.
• Женщинам старше 70 лет, не имеющим жалоб на состояние половой системы, такой анализ не обязателен. Однако пациенткам, перенесшим рак или предрак шейки матки и страдающим папилломавирусной инфекцией, следует проходить такое обследование в любом возрасте вне зависимости от наличия неблагоприятных симптомов.
• Внепланово анализ сдается при появлении обильных выделений, особенно с примесью крови и гноя, а также кровотечений, возникающих после полового контакта.

Рекомендуется пройти такое исследование на этапе планирования беременности, чтобы заблаговременно вылечить имеющуюся патологию.

Как подготовиться к жидкостной цитологии

• За сутки до взятия материала нужно исключить половые контакты.
• За 3 дня прекращается введение вагинальных лекарственных препаратов и спринцевание.

Другой подготовки к взятию мазка не требуется. Перед посещением врача достаточно простых гигиенических процедур.

На какой день надо сдавать жидкостную цитологию

Во время критических дней материал для обследования не берется. Анализ необходимо сдать не раньше 5 дня менструального цикла и не позже чем за 5 дней до начала следующего менструального кровотечения.

Как берется образец на жидкостную цитологию

Материалом для проведения анализа служат образцы слизистой, взятые с шейки. Для их забора используется специальная щеточка, конструкция которой позволяет захватить образцы слизистой с наружной поверхности шейки (эктоцервикса) и из цервикального канала (эндоцервикса).

Брать клетки слизистой для проведения жидкостной цитологии не больно. Иногда после процедуры  могут наблюдаться незначительные кровянистые выделения, продолжающиеся несколько часов и самостоятельно проходящие.

Жидкостная цитология отличается от обычной методом приготовления препарата:

• При традиционном анализе взятый мазок переносится на сухое стекло, а затем высушивается. Окраска образца проводится вручную. Поэтому мазок часто окрашивается неравномерно, а результат может исказиться за счет примеси крови, гноя, белковых соединений.
• При взятии жидкостной цитологии материал помещается в контейнер со специальной консервирующей жидкостью. Приготовление препарата и его окраска при жидкостной цитологии делается автоматически в лаборатории.

После забора материала проводится клеточное обогащение образца. Содержимое контейнера перемешивают и помещают в центрифугу. При этом клетки разделяются на слои. Элементы крови, белок, разрушенные клеточные структуры остаются вверху, и их можно легко слить. Внизу остаётся чистый образец, идеально подходящий для анализа.

Нижний клеточный слой переносится на предметное стекло и окрашивается. Специальный аппарат, с помощью которого делают жидкостную цитологию, проводит контроль качества образцов, отсеивая неправильно приготовленные, неинформативные и не подходящие для диагностики.

После этого окрашенные мазки прогоняют через анализатор – прибор, который отмечает подозрительные стекла, требующие пересмотра специалистом-цитологом. Сочетание двух видов контроля – аппаратного и врачебного – позволяет максимально увеличить точность исследования.

Помимо анализа жидкостной цитологии шейки матки на рак и предрак, полученный образец можно проанализировать на другие показатели:

• Наличие вируса папилломы человека, провоцирующего дисплазию (предрак) и онкологические поражения шейки матки. Такое обследование называется ВПЧ-тестом.
• Наличие онкобелка P16ink4a, обнаружение которого указывает на высокий риск злокачественной трансформации очага на шейке матки.

Преимущества жидкостной цитологии

• Возможность получения высококачественного биоматериала. Для транспортировки и хранения образцов используются специальные контейнеры, а система обогащения способствует тщательной очистке клеток слизистой от примесей.
• Максимальная сохранность материала – жидкостная цитология позволяет наиболее полно сохранить молекулярно-биологические свойства образцов.
• Низкая вероятность ошибки – в контейнер с раствором попадает весь эпителиально-клеточный материал. Поэтому врач не пропустит раковые или предраковые клетки, даже если они находятся в небольшом количестве.
• Минимальное число ложноположительных результатов и высокая точность исследования. Методика выявляет рак шейки матки в 100% случаях, а различные степени дисплазии (предрака) – в 98% случаев.
• Длительные сроки хранения образцов, помещенных в специальные стабилизирующие растворы.
• Возможность быстрого получения результата, достигаемого частичной автоматизацией исследования. Жидкостная цитология делается по времени не более одного рабочего дня.

Как расшифровать жидкостную цитологию

• NILM – отсутствие предраковых и злокачественных патологий. В образце обнаруживаются только клетки многослойного эпителия, покрывающего шейку матки, и цилиндрического, находящегося в цервикальном канале. В мазке также присутствует здоровая флора половых путей. Этот результат считается нормой.
• ASC-US – обнаружены клетки эпителия, имеющие сомнительную структуру и происхождение, возможно, потенциально злокачественные. Такой женщине назначается дополнительное обследование.
• LSIL – слабая степень дисплазии. В этом случае диспластические процессы не проникли глубоко в слизистую. Такая картина жидкостной цитологии цервикального канала соответствует первой степени дисплазии – CIN I – и появляется при начавшемся предраковом перерождении.
• HSIL – более тяжёлая вторая-третья степень дисплазии (CIN II, CIN III), при которой предраковые изменения уже глубоко проникли внутрь слизистой.
• AIS – аденокарцинома in situ (рак на месте) – начальная стадия рака, при которой он ещё не вышел за границы слизистой оболочки и не распространился на остальные ткани.

 Классификация результатов жидкостной цитологии

• Первый класс – клетки не изменены, имеют правильную форму и размеры. Такой итог жидкостной цитологии считается нормой.
• Вторая – цитологическая картина соответствует воспалительному или инфекционному процессу. В этом случае женщине нужно сдать мазок на флору и пройти кольпоскопию – осмотр слизистой шейки матки с помощью прибора-кольпоскопа.
• Третий класс – строение и форма клеток изменены. Их количество небольшое. Такой женщине нужно будет через некоторое время сделать повторную жидкостную цитологию шейки матки, чтобы исключить развитие предрака и рака.
• Четвёртый класс – в мазке обнаруживается большое количество диспластических, неправильно развитых клеток. При таком результате жидкостной цитологии женщине назначается биопсия – взятие с измененных участков шейки образцов на гистологическое (клеточное) исследование, подтверждающее или исключающее раковую опухоль.
• Пятый класс – обнаруживаются предраковые и злокачественные клетки. Такая картина соответствует различным формам рака шейки матки.

В результатах анализа также указываются данные об имеющейся патогенной микрофлоре. Это дает возможность выявить различные инфекции.

Пройти исследование жидкостной цитологии можно в «Университетской клинике», где имеется всё необходимое оборудование для проведения такого анализа. Врачи расшифруют данные и назначат лечение выявленных заболеваний.